馬盈，蘭士波，李紅艷

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081）

歐洲花楸的離體培養(yǎng)與快繁體系建立

馬盈，蘭士波，李紅艷

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081）

選用歐洲花楸葉片、腋芽作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，確定腋芽為誘導(dǎo)培養(yǎng)的外植體。通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，從而建立了一套“初代培養(yǎng)——繼代培養(yǎng)——生根培養(yǎng)”的無(wú)性繁殖體系。

歐洲花楸；離體培養(yǎng)；正交試驗(yàn)；快繁體系

歐洲花楸（Sorbus aucuparia），系薔薇科花楸屬落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)歐洲和亞洲西部。歐洲花楸為喜光和半耐陰先鋒樹(shù)種，耐旱、耐寒，喜濕潤(rùn)的酸性或微酸性土壤。歐洲花楸在歐洲已被廣泛應(yīng)用于園林綠化中，如在芬蘭它是重要的行道樹(shù)之一[1]。歐洲花楸具有四季皆宜的觀賞效果，是集觀賞花、葉、果等價(jià)值于一身的珍貴花木，可作庭院、公園、廣場(chǎng)、小區(qū)綠化；它的葉子具有通便、祛痰功效，果實(shí)具有收斂利尿和抗壞血癥的藥用功效外，還可用于加工食品、飲料、酒及藥品，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊?？傊瑲W洲花楸是集園林樹(shù)種、經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種和生態(tài)樹(shù)種于一身的優(yōu)良品種。

良種繁育方式包括有性繁殖和無(wú)性繁殖。歐洲花楸屬于高位芽植物，完全靠種子繁殖。由于該種種子呈深度和絕對(duì)休眠狀態(tài)，所以需要一定的低溫層積催芽處理，以克服來(lái)自種和胚的休眠[2]。而扦插繁殖存在插穗不足，且生根率較低。這兩種方法都不能進(jìn)行大批量的生產(chǎn)，不能滿足苗木市場(chǎng)的需求。植物的組織培養(yǎng)是利用細(xì)胞全能性，除具備常規(guī)營(yíng)養(yǎng)繁殖的優(yōu)點(diǎn)外，還具有繁殖速度快、不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，而且采用腋芽增殖進(jìn)行快繁體系的建立可以保持品種的優(yōu)良性狀。本項(xiàng)目擬通過(guò)試驗(yàn)研究建立歐洲花楸組織培養(yǎng)快繁體系，為其進(jìn)一步引種栽培和開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及消毒處理

2007年1月4日在黑龍江省森林植物園引種栽培的歐洲花楸植株上剪取當(dāng)年生帶休眠芽枝條，放置于常溫室內(nèi)進(jìn)行水培，萌動(dòng)后剪取展開(kāi)的葉片和帶側(cè)芽的莖段做為試驗(yàn)材料。

將試驗(yàn)材料放入洗潔精溶液（洗潔精：水=500∶1）中，攪拌洗滌之后用清水沖洗干凈。在無(wú)菌環(huán)境下首先用75%的酒精溶液消毒20 s，再用0.1%的HgCl溶液滅菌3～5 min，無(wú)菌水漂洗4～5次，最后在無(wú)菌水中浸泡40 min左右，取出后，用無(wú)菌濾紙吸干滅菌材料表面水分待用。

1.2 初代與誘導(dǎo)培養(yǎng)

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表、誘導(dǎo)率及多重比較結(jié)果

通過(guò)3因子3水平正交試驗(yàn)法L9（34）設(shè)計(jì)9個(gè)培養(yǎng)基組合（見(jiàn)表1）。將外植體接于9種培養(yǎng)基上，每瓶3個(gè)，每種培養(yǎng)基組合接5瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度20～26℃，光照時(shí)間12 h/d，光強(qiáng)2 000 lx。觀察芽誘導(dǎo)情況，20 d后統(tǒng)計(jì)分化率和苗高。通過(guò)正交設(shè)計(jì)分析數(shù)據(jù)，篩選出最佳培養(yǎng)基。

1.3 繼代與增殖培養(yǎng)

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表、增殖倍數(shù)及多重比較結(jié)果

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并加入2%的瓊脂和3%的蔗糖。選6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA（0.1、0.3、0.6 mg/L）、IAA（0.2、0.4、0.8 mg/L）3種激素，選用正交設(shè)計(jì)L9（34）方法（見(jiàn)表2）。將初代培養(yǎng)生長(zhǎng)30 d后的歐洲花楸單節(jié)切段，植入9種培養(yǎng)基中。每瓶植入3～4個(gè)外植體，每種培養(yǎng)基接種3～4瓶，重復(fù)3次。接種20 d后觀察材料生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。

1.4 生根培養(yǎng)

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及生根系數(shù)多重比較

生根培養(yǎng)基中，MS為基本培養(yǎng)基，附加激素為KT（0.5、1.0、2.0 mg/L）、NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）和IBA（0、0.5、1.0 mg/L）3種，將試管苗分成每段約2.0～3.0 cm后分別植入添加不同濃度的L9（34）的9種生根培養(yǎng)基中（見(jiàn)表3），觀察幼苗生根情況及其生根數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用方差分析和差異顯著性測(cè)驗(yàn)（SSR法），對(duì)歐洲花楸腋芽增殖倍數(shù)、幼苗生根數(shù)和生根率等指標(biāo)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片、腋芽分化能力比較

將葉片、腋芽植入相同培養(yǎng)基中觀察其誘導(dǎo)分化狀況得出：腋芽分化能力明顯強(qiáng)于葉片，葉片植入兩周出現(xiàn)愈傷組織，三周后沒(méi)有出現(xiàn)再分化；而腋芽植入一周開(kāi)始萌動(dòng)，兩周已有幼芽分化，一個(gè)月的生長(zhǎng)高度約為2.0～3.5 cm。

2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

通過(guò)試驗(yàn)確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)次序?yàn)?/2MS＞MS＞H。通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、6-BA及NAA3個(gè)因素的方差分析，對(duì)歐洲花楸腋芽誘導(dǎo)率順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基＞6-BA＞NAA。分析結(jié)果表明：3種因素均為影響分化率的主導(dǎo)因子，達(dá)到了極顯著水平（P=0.000 1）。由表1可知，f2與f3培養(yǎng)基分化效果最好，且差異不顯著。但通過(guò)對(duì)試管苗的觀察，f3中的幼苗存在玻璃化現(xiàn)象，而f2中的幼苗粗壯，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。因此篩選f2（1/2MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.02 mg/L）為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率可達(dá)94.81%。

2.3 幼苗增殖培養(yǎng)基的篩選

選取MS為基本培養(yǎng)基，選擇激素6-BA、NAA和IAA3種，將試管苗剪為2.0 cm左右，將其植入不同激素配比的培養(yǎng)基中，兩周后統(tǒng)計(jì)的增殖倍數(shù)并進(jìn)行方差分析并利用SSR法多重比較。由表2可知：以Z3培養(yǎng)基中的幼苗增殖倍數(shù)最高，達(dá)到6.35倍，確定細(xì)胞分裂素6-BA為影響歐洲花楸芽增殖生長(zhǎng)的重要因子，最佳濃度為2.0 mg/L。因此篩選出歐洲花楸最佳增殖培養(yǎng)基為Z3：MS+BA2.0 mg/L+ NAA0.05 mg/L，每周增殖系數(shù)為4.16。

2.4 幼苗生根培養(yǎng)基的篩選

將增殖培養(yǎng)的試管苗植入9種生根培養(yǎng)基中，兩周后調(diào)查試管苗的生根數(shù)量并觀察根系茁壯度及其長(zhǎng)度，通過(guò)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析，3種激素影響力為IBA＞NAA＞KT，影響生根的主要因子為IBA和NAA。通過(guò)對(duì)生根數(shù)量和生根率的多重比較得出結(jié)論（表3）：S5、S6培養(yǎng)基中的試管苗生根數(shù)量較多，兩者差異不顯著；培養(yǎng)基S4、S5、S8生根率較高，一周左右出現(xiàn)根系生長(zhǎng)，兩周左右根系長(zhǎng)度可達(dá)1.0～2.0 cm，兩者間差異并不顯著。綜上所述，確定生根數(shù)量多且根系茁壯的最佳生根培養(yǎng)基為S5（MS+ NAA0.1 mg/L+IBA0.5 mg/L），根系數(shù)量為8.74條，生根率為96.52%。

3 結(jié)論與討論

（1）離體無(wú)性系快速繁殖是植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用最廣泛的方向之一，離體培養(yǎng)的成功與否主要取決于外植體、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、外源激素培養(yǎng)基以及生長(zhǎng)條件等多種因素。在歐洲花楸離體培養(yǎng)中，確定以腋芽為外植體效果好于葉片，葉片誘導(dǎo)分化后只有愈傷組織分化，未有器官形成。有研究顯示：通過(guò)愈傷組織分化形成的再生植株的嚴(yán)重缺點(diǎn)是遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異[3]。而且選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w可以減少褐變的發(fā)生。綜上所述，確定歐洲花楸腋芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立。

（2）外源激素可以誘導(dǎo)出愈傷組織、胚狀體、不定芽、根等器官，最終獲得再生植株或次生物質(zhì)[4]。6-BA是一種活性較強(qiáng)的細(xì)胞分裂素，主要功能為促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的形成。如在本實(shí)驗(yàn)腋芽分化誘導(dǎo)中，以f2（1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.02）為最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為94.81%；在繼代增殖培養(yǎng)中，以Z3（MS+BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L）為最佳培養(yǎng)基，每周增殖系數(shù)為4.16；在生根培養(yǎng)中，確定最佳生根培養(yǎng)基為S5（MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.5 mg/ L），根系數(shù)量為8.74條，生根率為96.52%。

（3）在本研究中f3（1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L）中幼苗有明顯玻璃化現(xiàn)象，而玻璃化的發(fā)生是“生長(zhǎng)因子不平衡的產(chǎn)物”、是培養(yǎng)物“中毒”，不能很好適應(yīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境的結(jié)果。增加瓊脂濃度，適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量、適當(dāng)降低培養(yǎng)基中NH+4濃度，改善培養(yǎng)器內(nèi)溫度、濕度及光照都是減少玻璃化發(fā)生的方法[5]。

[1]周丹，宿宗艷，李文娟，李長(zhǎng)海.歐洲花楸應(yīng)用價(jià)值的探討[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2007，10（5）:83-84.

[2]田艷麗，鄭國(guó)慶，徐娟，李長(zhǎng)海.歐洲花楸有性繁殖試驗(yàn)[J].陜西林業(yè)科技，2009，2:15-16.

[3]鄭玉梅，劉青林.木本觀賞植物離體快速繁殖技術(shù)的進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23（增刊）:75-82

[4]韓磊，汪東旭等.植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].種子（Seed），2005，24（1）:38-43.

[5]楊麗琴，李瑞，王俊，等.植物組織培養(yǎng)的三大難題[J].北方園藝，2008（4）:104-107

（責(zé)任編輯：楊婷婷）

Isolated Culture and Establishment of a Rapid Propagation System for Sorbus aucuparia

MA Ying，LAN Shibo，LI Hongyan
（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150081，China）

In this paper the leaves and axillary buds of Sorbus aucuparia were used as explants for induction tests and the axillary buds were used as explants for induction culture.The best culture media for induction culture，multiplication culture and rooting culture were screened out by orthogonal tests，and a asexual propagation system of“primary culture-subculture -rooting culture”was established

Sorbus aucuparia；Isolated culture；Orthogonal tests；Rapid propagation

S792.25

：A

：2095-0152（2014）01-0030-03

2014-01-08

2014-01-11

馬盈（1981-），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。E-mail:191008853@qq.com