（廣東省廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院）

維生素是維持人體生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝而必須從食物中獲得的微量有機(jī)物質(zhì)之一。許多食品會(huì)添加維生素，但強(qiáng)化維生素應(yīng)符合適宜人群的攝入量，應(yīng)能在特定條件下保持質(zhì)量的穩(wěn)定。加大對(duì)維生素檢測(cè)方法及技術(shù)的研究，對(duì)科學(xué)控制維生素在食品中的添加量具有重要的意義。

維生素B12(VB12)，又稱(chēng)鈷胺素（Cobalamin），是非常重要的水溶性維生素之一，主要用于保健食品、谷物、飲料、乳品和嬰兒食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。由于食品成分復(fù)雜、存在多種干擾因素，而且其VB12的含量十分微量，因此化學(xué)分析法的應(yīng)用受到限制。目前，微生物法仍為國(guó)際官方機(jī)構(gòu)測(cè)定VB12的的首選認(rèn)可方法。

雖然微生物法在維生素檢測(cè)過(guò)程中有較高的靈敏度和精確度[1]，但是仍然存在步驟繁瑣、操作耗時(shí)、檢測(cè)周期長(zhǎng)、易受外部因素干擾等諸多問(wèn)題[2]。本文建立了微生物法測(cè)定食品中VB12含量的快速方法，與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)法相比具有檢測(cè)周期短、操作步驟簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性高的優(yōu)勢(shì)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmanniii），ATCC 7830，來(lái)源為美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為：乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，VB12測(cè)定培養(yǎng)基；均來(lái)自BD（碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司上海辦事處）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品為VB12，來(lái)自USP（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 緩沖液

無(wú)水磷酸氫二鈉0.65 g（廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)），無(wú)水偏重亞硫酸鈉0.01 g（上?；瘜W(xué)試劑總廠(chǎng)），一水合檸檬酸0.6 g（廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)）；用100 mL蒸餾水溶解制得緩沖液，使用前配制。

1.5 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品為：SRM 1849a（NIST，National Institute of Standards and Technology）、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種的制備

將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物離心洗去肉湯培養(yǎng)基，并使用含有甘油的測(cè)定培養(yǎng)基進(jìn)行適宜的稀釋?zhuān)尤?6排管中，零下80 ℃凍存。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

VB12標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為1.25 ng/mL，在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾備用。

2.3 操作步驟

2.3.1 樣品的處理

（1）配方乳粉、含乳飲料等樣品：稱(chēng)2～5 g樣品，充分溶解后加入緩沖液水解，在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾，根據(jù)樣品中的VB12的標(biāo)稱(chēng)含量進(jìn)行稀釋。

（2）配方米粉等樣品：稱(chēng)2～5 g樣品，加入淀粉酶溶液酶解，滅活后在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾，根據(jù)樣品中VB12的標(biāo)稱(chēng)含量進(jìn)行稀釋。

（3）功能飲料等樣品：在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾得到樣品溶液，根據(jù)樣品中維生素B12的標(biāo)稱(chēng)含量進(jìn)行稀釋。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

在無(wú)菌條件下，按表1順序在滅菌小管中對(duì)VB12標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋?zhuān)苽湎鄳?yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。

表1 VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的制備

將凍存有試驗(yàn)接種菌懸液的小管恢復(fù)到室溫，在每管中加入300 μL系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和300 μL無(wú)菌維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基，一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。

2.3.3 樣品測(cè)定液

在無(wú)菌條件下，按表2順序在滅菌小管中對(duì)樣品測(cè)定液進(jìn)行稀釋?zhuān)苽湎鄳?yīng)濃度的樣品測(cè)定溶液。

將凍存有試驗(yàn)接種菌懸液的小管恢復(fù)到室溫，在每管中加入300 μL系列樣品測(cè)定溶液和300 μL無(wú)菌VB12測(cè)定培養(yǎng)基，一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。

2.3.4 培養(yǎng)

（36±1.0）℃培養(yǎng)24～28 h。

2.3.5 測(cè)定

混合均勻，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。平行小管相對(duì)偏差小于15%的為有效數(shù)值。

表2 VB12樣品測(cè)定液的制備

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管VB12含量做橫坐標(biāo)，以吸光度做縱坐標(biāo)，根據(jù)四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9989。

3.2 VB12含量的計(jì)算

根據(jù)每管的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得對(duì)應(yīng)的VB12含量，除以相對(duì)樣液體積（v），得到每管樣品溶液中VB12含量。由所有有效管中測(cè)得的數(shù)值計(jì)算平均值（Cx）。樣品中VB12含量按下列公式計(jì)算：

m（g）為樣品質(zhì)量，f為樣品稀釋倍數(shù)。

以SRM 1849a、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料為試驗(yàn)樣品，每種樣品作6 次平行試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。所測(cè)數(shù)據(jù)表明該方法測(cè)定VB12含量有效，重復(fù)性良好。

圖1 VB12含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3.3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

選擇已知維生素B12含量的配方乳粉作為加標(biāo)試驗(yàn)樣品，在樣品稀釋液中加入一定體積的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量分別為25.0，50.0，100.0 ng，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示；回收率為94.2%～103.1%，試驗(yàn)靈敏度高。

表3 VB12含量檢測(cè)結(jié)果

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 與國(guó)標(biāo)方法GB 5413.14—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定》[3]的比較

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為傳統(tǒng)微生物法，存在步驟繁瑣、操作耗時(shí)、檢測(cè)周期長(zhǎng)、易受外部因素干擾等諸多問(wèn)題。

在本方法中，試驗(yàn)體系的體積縮小，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的制備可以使用1.2 mL小管和移液器進(jìn)行操作，使得操作更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，且代替了大量的容量瓶、試管和移液管等，既節(jié)省了人工也避免了雜質(zhì)、活性物質(zhì)等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。本文方法將試驗(yàn)菌株預(yù)先固定在96排管，利用甘油保護(hù)冷凍的菌種[4]，極大地縮短了試驗(yàn)周期，在提高試驗(yàn)效率的同時(shí)，使菌株的活力更加穩(wěn)定，保證了試驗(yàn)的有效性。在維生素檢測(cè)過(guò)程中有較高的靈敏度和精確度。

4.2 與商品化維生素檢測(cè)試劑盒的比較

商品化維生素檢測(cè)試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于操作步驟簡(jiǎn)便[5]，但是其配套標(biāo)準(zhǔn)溶液的保藏與制備是影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，并且如果樣品溶液只做一個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)也會(huì)極大地影響結(jié)果準(zhǔn)確性。同時(shí)試劑盒價(jià)格十分昂貴，加重了維生素檢驗(yàn)的負(fù)擔(dān)。

在本文方法中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確可靠，樣品溶液采取多個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，保證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。同時(shí)采用小管進(jìn)行培養(yǎng)，更利于試驗(yàn)溶液的充分混勻并減少了試驗(yàn)污染風(fēng)險(xiǎn)。

4.3 技術(shù)要點(diǎn)總結(jié)

在微生物法檢測(cè)微量維生素含量試驗(yàn)中，試驗(yàn)菌種的活力是影響試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素， 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制是影響試驗(yàn)結(jié)果的直接因素。試驗(yàn)過(guò)程中須注意避免雜質(zhì)對(duì)試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的影響。在制備樣品測(cè)定液的過(guò)程中，須注意稀釋液的均勻性，并采用適宜的稀釋倍數(shù)。微量稀釋過(guò)程中要保證準(zhǔn)確性。

4.4 微生物法測(cè)定VB12含量的優(yōu)點(diǎn)

維生素分析檢測(cè)工作對(duì)于評(píng)價(jià)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、控制強(qiáng)化食品中維生素的加入量具有重要意義。微生物法測(cè)定VB12含量的快速方法，操作步驟簡(jiǎn)便，有利于建立有效的試驗(yàn)流程和質(zhì)量管理，保證了試驗(yàn)的有效性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，適于在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室建立和應(yīng)用。

[1]Gregory M E. The microbiological assay of Vitamin B12in the milk of different animal species. British Journal of Nutrition，1954（8）：340-347.

[2]張麗宏，王克新，王淼，等. 微生物法測(cè)定乳粉中維生素B12的應(yīng)用和探討. 中國(guó)乳品工業(yè)，2008，36（10）：58-60.

[3]GB 5413.14—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定.

[4]Grossowicz N，Waxman S，Schreiber C. CryoprotectedLactobacillus casei：an approach to standardization of microbiological assay of Folic acid in Serum. Netherlands Journal of Immunological Methods，1981，46（2）：129-140.

[5]黃曉林，王淼，張麗宏，等. IFP微孔板試劑盒檢測(cè)配方乳粉中維生素B12方法探討. 中國(guó)乳品工業(yè)，2010（7）：48-49.