柏永昊，熊小毛，繆禮鴻 *，陳文靜

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

中國傳統(tǒng)白酒以谷物為原料，采用大曲或小曲提供糖化力和發(fā)酵力，經(jīng)過浸泡、蒸煮、堆積、發(fā)酵和蒸餾等工序制成。其制曲工藝多為敞開式人工制曲，堆積培菌后進入窖池，窖泥微生物參與到發(fā)酵過程中來，因而固態(tài)法發(fā)酵白酒是一個由多種微生物參與的復(fù)雜轉(zhuǎn)化過程[1]。研究白酒中的微量組分與微生物之間的關(guān)系已成為熱點[2]。高級醇作為白酒呈香呈味的物質(zhì)之一，能襯托酯類的香氣，含量太低會導(dǎo)致口味淡薄，但含量太高會引起酒體辛辣苦澀，刺激神經(jīng)，使人上頭易醉[3]，因此我國白酒行業(yè)對高級醇含量有著嚴(yán)格的限制。正丙醇是高級醇的重要組分之一，在不同香型白酒中差異較大，兼香型白酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對其含量要求為0.2～1.0g/mL[4]。

固態(tài)白酒發(fā)酵過程中高級醇的產(chǎn)生機理尚不清楚，因此目前國內(nèi)的研究主要從改變工藝條件對其加以控制，如改變投糧量、加曲量、加糠量、接種溫度等[5-7]。國外學(xué)者針對高級醇產(chǎn)生的機理，從細(xì)菌、酵母菌等菌種角度展開了研究。JANSSEN P H[8]證實了一株厭氧梭菌（Anaerobic clostridium）能夠發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生丙酸和正丙醇。CARRAN F M[9]發(fā)現(xiàn)在低氮水平下，一株葡萄酒酵母能產(chǎn)生更多高級醇。酵母菌的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性與葡萄酒的高級醇產(chǎn)生量呈正相關(guān)[10]。而有關(guān)正丙醇的產(chǎn)生機理有2個推論：其一，蛋白質(zhì)分解機理，即蛋白質(zhì)分解為氨基酸，氨基酸被酵母菌或細(xì)菌利用，蘇氨酸脫胺基、脫羧基形成正丙醇；其二，糖的厭氧發(fā)酵機理，即氨基酸中間代謝產(chǎn)物α-酮丁酸脫羧、還原生成正丙醇[11]。受蛋白質(zhì)分解機理的影響，國內(nèi)白酒行業(yè)普遍懷疑正丙醇的產(chǎn)生與堆積料的耐高溫細(xì)菌有關(guān)。細(xì)菌是窖泥中的主要微生物，也被廣泛關(guān)注[12]。本課題組前期的研究已表明芽孢桿菌不是白酒中正丙醇產(chǎn)生的主要因子[13]，在此基礎(chǔ)上，本研究旨在進一步研究固態(tài)法發(fā)酵白酒中正丙醇產(chǎn)生的機理，為白酒釀造過程中正丙醇等高級醇產(chǎn)生量的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

根霉（Rhizopus）2-1：分離自“白云邊”小曲曲粉；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2-5M：分離自“白云邊”小曲出池酒醅。

1.1.2 樣品來源

“白云邊”大曲二輪入池酒醅、三輪出池上中下層酒醅及混合酒醅、“白云邊”小曲曲粉、高粱等均由白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1 000mL，pH 7.2～7.4。

虎紅培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，取35g溶于1 000mL蒸餾水。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母粉10g，水1 000mL。

1.1.4 試劑

葡萄糖、氯化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。牛肉膏、酵母粉、蛋白胨：英國OXOID公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZGP-2050普通生化培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；Nikon YS100顯微鏡：廣州頤騰貿(mào)易有限公司；7890A氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒醅中細(xì)菌、酵母菌活菌數(shù)的測定方法

稱取10g酒醅樣品，加入裝有90mL無菌水的三角瓶中，170r/min搖床15min后，采用稀釋平板法[14]分別涂布于牛肉膏蛋白胨平板及虎紅平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，計數(shù)，取單菌落劃線分離、鏡檢。

1.3.2 工廠酒醅取樣及蒸餾方法

分別取A、B兩個班組的“白云邊”大曲酒二輪入池酒醅、三輪出池酒醅（上、中、下層）樣品各50g用于酒精蒸餾。蒸餾液經(jīng)過濾后用氣相色譜法測定正丙醇含量。

普通蒸餾操作：取50g酒醅，加入150mL蒸餾水，蒸餾取酒樣100mL。

取頭酒蒸餾操作：取50g酒醅，加入100mL蒸餾水，蒸餾酒樣只取前15mL。

1.3.3 實驗室同步裝瓶發(fā)酵方法

現(xiàn)場取工廠已堆積結(jié)束、即將入池的酒醅裝入750mL的玻璃菌種瓶中，裝滿后壓緊，用8層保鮮袋封口，置于生化培養(yǎng)箱28℃發(fā)酵30d，取出酒醅進行蒸餾，過濾后用氣相色譜法測定正丙醇含量。

1.3.4 實驗室模擬小曲白酒發(fā)酵方法

取600g高粱于60～70℃蒸餾水中浸泡24h后取出，放置于蒸鍋上層，用紗布墊好，下層加水燒開，蒸粱1h。之后用100℃沸水浸泡燜粱0.5h，復(fù)蒸高粱1h，攤晾高粱，使之冷卻至30℃。接種小曲曲粉（接種量0.5%）后混勻。39～41℃堆積30h左右。將堆積料裝入750mL的玻璃菌種瓶中，裝滿后壓緊，用8層保鮮袋封口，置于生化培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)。發(fā)酵6d，取出酒醅蒸餾（普通蒸餾操作，同上），過濾后用氣相色譜測定蒸餾液中正丙醇含量及酒精度。

1.3.5 實驗室模擬小曲酒固態(tài)純種發(fā)酵方法

基本方法同1.3.4，接種時用2%純種培養(yǎng)的種子液替代小曲曲粉。種子液培養(yǎng)方法：YPD平板活化根霉2-1和酵母菌2-5M，30℃培養(yǎng)36h后，轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液態(tài)培養(yǎng)基中，170r/min搖床培養(yǎng)12h。

1.3.6 蒸餾液中正丙醇及酒精含量的測定方法

蒸餾液中酒精、正丙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯的含量測定均采用氣相色譜測定法[15]。

1.3.7 色譜條件

色譜柱：極性柱DB-WAXETR；載氣為高純氮氣；流速為25mL/min，分流比為20∶l，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為400mL/min。起始柱溫為60℃，保持2min，然后以5℃/min程序升溫至80℃。檢測器溫度：200℃；進樣口溫度：200℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 工廠大曲入池和出池酒醅微生物數(shù)量測定結(jié)果

圖1 大曲酒酒醅活菌數(shù)測定結(jié)果Fig.1 The count results of microorganism in Daqu fermented grains

由圖1可知，大曲三輪出池酒醅中的細(xì)菌和酵母菌與二輪入池相比均大大降低，少量存活下來的為具有一定耐酒精能力的菌株。三輪出池下層酒醅的細(xì)菌數(shù)和酵母總數(shù)均高于中層和上層酒醅菌數(shù)，可能是由于下層酒醅含水率相對較高，易于菌體生長。

2.2 工廠大曲酒醅與實驗室同步模擬發(fā)酵酒醅結(jié)果比較

表1 工廠A組大曲酒醅取樣蒸餾與實驗室同步模擬發(fā)酵酒醅結(jié)果比較Table 1 Comparison of fermented distilled grains between samples from group A and synchronize simulate fermentation in lab

如表1所示，對比“工廠二輪入池酒醅”與“工廠三輪出池酒醅”，前者正丙醇含量為0，即堆積后沒有正丙醇產(chǎn)生，而出池酒醅正丙醇含量為334.16mg/L，這表明正丙醇產(chǎn)生于入池發(fā)酵過程中，而不是在堆積過程中。與此相反，堆積后乙酸乙酯含量為312.1mg/L，遠(yuǎn)高于出池酒醅中的含量10.92mg/L，表明乙酸乙酯主要累積于堆積過程中。對比“工廠三輪出池酒醅”與“實驗室同步三輪出池酒醅”，由于后者沒有窖泥微生物的參與，但正丙醇含量達820.80mg/L，甚至超過了前者的正丙醇含量334.16mg/L，這表明正丙醇的產(chǎn)生與窖泥微生物無關(guān)。其含量過高的原因，推測是由于實驗室發(fā)酵條件比工廠更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌種更早建立，因此乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯的含量也有一定差異性。對比“實驗室同步三輪出池酒醅”和其“取頭酒”的數(shù)據(jù)，后者的正丙醇含量大幅增加，表明蒸餾酒樣品中正丙醇含量與蒸餾和收集方法直接相關(guān)。乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的含量也隨取頭酒操作而增加。

如表2所示，工廠B組三輪出池的中、下層酒醅正丙醇含量均高于上層，而圖1反映了中、下層酒醅中的酵母菌活菌數(shù)也高于上層，由此可以看出，隨著取樣深度的增加，大曲酒醅的正丙醇含量和酵母菌數(shù)量呈正相關(guān)。與此相反地，下層酒醅的乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的含量卻低于上、中層，表明下層酒醅的發(fā)酵條件和環(huán)境抑制了產(chǎn)酯微生物的代謝，不利于優(yōu)質(zhì)白酒的產(chǎn)出。B組的實驗室同步三輪出池酒醅正丙醇含量為4 808.86mg/L，同樣超過了工廠的三輪出池酒醅，與A組的結(jié)果一致。這也表明正丙醇的產(chǎn)生與窖泥微生物無關(guān)。但是實驗室過于穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境使參與發(fā)酵的微生物種類變少，酯類含量與工廠出池酒醅有差異。

表2 大曲B組工廠取樣蒸餾與實驗室同步裝瓶發(fā)酵酒醅結(jié)果（取頭酒）Table 2 Comparison of fermented distilled grains between samples from group B and synchronize bottle fermentation in lab(the first liquor)

2.3 模擬小曲發(fā)酵過程中正丙醇產(chǎn)生時間及微生物數(shù)量的變化

圖2 小曲酒模擬發(fā)酵過程中正丙醇與酒精度含量的變化Fig.2 The propanol content and alcohol content change during Xiaoqu simulated fermentation

如圖2所示，在實驗室模擬小曲發(fā)酵過程中，堆積結(jié)束時正丙醇的含量很低，與工廠堆積料的測定結(jié)果相一致，但堆積料在裝瓶發(fā)酵后的前24h，正丙醇含量激增，24h后增加速度趨于平緩，4d時正丙醇含量幾乎達到最大值，4d以后正丙醇含量增加十分緩慢。酒醅中酒精含量隨發(fā)酵時間延長逐步提高。

如圖3所示，裝瓶后酒醅中的細(xì)菌總活菌數(shù)在前24h內(nèi)急劇下降，2～4d內(nèi)趨于穩(wěn)定，4～6d細(xì)菌總數(shù)進一步降低；而酵母菌總活菌數(shù)在前24h內(nèi)顯著增加，2～4d內(nèi)趨于穩(wěn)定，4～6d又有明顯增加，其變化趨勢與細(xì)菌恰恰相反。由此可以看出，酵母菌數(shù)量和正丙醇含量在實驗室模擬小曲發(fā)酵過程中也是呈正相關(guān)的。因此可以推測固態(tài)法發(fā)酵白酒，無論是大曲酒還是小曲酒，正丙醇的含量與入池酒醅的酵母菌生態(tài)群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖3 小曲酒模擬發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)和酵母總數(shù)的變化Fig.3 The total bacterial and yeast amount during Xiaoqu simulated fermentation

2.4 模擬小曲固態(tài)純種發(fā)酵結(jié)果

如圖4、圖5所示，以接種小曲曲粉為對照，在整個發(fā)酵過程中，實驗室純種（僅接種根霉2-1和釀酒酵母2-5M）模擬小曲發(fā)酵的酒精產(chǎn)量與正丙醇產(chǎn)量均與對照組相近。表明釀酒酵母2-5M是模擬小曲發(fā)酵過程中正丙醇的主要產(chǎn)生菌株。

圖4 釀酒酵母2-5M純種模擬小曲發(fā)酵中正丙醇含量隨時間變化圖Fig.4 The time-varying propanol content of Xiaoqu simulated fermentation by pure Saccharomyces cerevisiae 2-5M

圖5 釀酒酵母2-5M純種模擬小曲發(fā)酵中酒精度隨時間變化圖Fig.5 The time-varying alcoholic content of Xiaoqu simulated fermentation by pure Saccharomyces cerevisiae 2-5M

3 結(jié)論

結(jié)果表明，酒醅中的酵母菌數(shù)量與其正丙醇含量成正相關(guān)。以不含窖泥的實驗室同步模擬大曲酒醅發(fā)酵試驗結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵白酒酒醅中正丙醇的產(chǎn)生不依賴于窖泥微生物的存在。取頭酒的實驗結(jié)果表明蒸餾酒樣品中正丙醇含量與蒸餾和收集方式直接相關(guān)。

實驗室小曲模擬發(fā)酵實驗結(jié)果表明，酒醅發(fā)酵過程中酵母菌總數(shù)與正丙醇含量成正相關(guān)，而與細(xì)菌總數(shù)成負(fù)相關(guān)。堆積料在裝瓶發(fā)酵后24h內(nèi)正丙醇含量激增，4d時正丙醇含量達到最大值。采用僅含釀酒酵母和根霉的純種接種劑與含細(xì)菌的小曲曲粉進行對比發(fā)酵試驗表明，兩者發(fā)酵的酒精度和正丙醇含量均接近。表明酵母菌是白酒中正丙醇的主要產(chǎn)生菌。實驗室接種小曲曲粉及純種發(fā)酵結(jié)果均表明，酒醅的酒精度與正丙醇含量基本呈正相關(guān)。由此可以推斷，固態(tài)法發(fā)酵白酒中正丙醇主要是在酵母菌進行糖的厭氧發(fā)酵過程中作為酒精的副產(chǎn)物產(chǎn)生的，而不是細(xì)菌對蛋白質(zhì)分解導(dǎo)致的。

為了控制正丙醇的含量，對于由多種微生物參與的固態(tài)法白酒發(fā)酵而言，可以首先篩選出入池發(fā)酵階段中的各種優(yōu)勢酵母菌，通過純種發(fā)酵和混合發(fā)酵的辦法找出產(chǎn)正丙醇高的酵母菌種類。進而研究其代謝條件。在工廠實際生產(chǎn)中，可以采用改變發(fā)酵條件抑制此類酵母菌代謝，或是選擇產(chǎn)酯高而產(chǎn)正丙醇低的菌株制成強化曲添加到接種環(huán)節(jié)中，達到控制正丙醇含量、提升酯類香味物質(zhì)的目的。本研究為提高優(yōu)質(zhì)白酒的人工控制水平提供了理論依據(jù)，對實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

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