張松梅

摘 要：目的：探討聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)生菌的篩選方法。方法：從土壤中取樣，經(jīng)過尼羅藍(lán)熒光初篩、蘇丹黑染色復(fù)篩，篩選菌株。結(jié)果：成功地獲得聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)菌并將其命名為Rhizobium sp.H2-5，其胞內(nèi)產(chǎn)物產(chǎn)率為36.96%。結(jié)論：通過尼羅藍(lán)熒光初篩、蘇丹黑染色復(fù)篩進(jìn)行聚羥基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選，方法準(zhǔn)確、可靠，值得應(yīng)用推廣。

關(guān)鍵詞：聚羥基脂肪酸酯；尼羅藍(lán)；篩選

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

Ls-C50L立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）；HZQ-Q 全溫振蕩搖床（中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Friocell 生化培養(yǎng)箱（BMHIndustruments Co.）；Anke TGL-16G 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；S-3700N掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；1%的尼羅藍(lán)溶液； 0.3%（w/v）的蘇丹黑B染液、0.5%（w/v）的番紅染液等。

富集培養(yǎng)基（g/L）[1]：醋酸鈉10.0，酵母粉1.5，Na2HPO4·12H2O 3.8，KH2PO42.65，MgSO4·7H2O 0.2，CaC12 0.05，F(xiàn)eC130.01，ZnSO40.01；篩選培養(yǎng)基：含瓊脂2%，尼羅藍(lán)濃度為50μg/mL的富集培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 初篩[2]

取溶于水的土壤樣品上層液1.0mL，接于10.0mL富集培養(yǎng)液中32℃富集培養(yǎng)24h，反復(fù)傳代培養(yǎng)至獲得純培養(yǎng)菌株。取富集培養(yǎng)液對滅菌后篩選培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布到初篩培養(yǎng)基上。初篩培養(yǎng)基32℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)48h，在波長365nm紫外燈下觀察，標(biāo)記并挑取發(fā)熒光的單菌落保存。

1.2.2 復(fù)篩

純培養(yǎng)菌株搖床培養(yǎng)48h后，離心分離棄上清液，挑取離心后得到的菌體涂片、干燥、固定，蘇丹黑B染液染色15min，洗脫至無色，再用番紅染液復(fù)染2min，水洗，鏡檢觀察是否有藍(lán)黑色的脂肪顆粒[3]。

1.2.3 PHA提取

取復(fù)篩后的菌株搖床培養(yǎng)，收集、離心發(fā)酵液，收集菌體并烘干至恒重，稱量得干菌體重量（CDW/g）。加入氯仿超聲提取，向提取液中加入50ml甲醇水溶液析出白色絮狀固體PHA[4]，抽濾分離出PHA，再次烘干至恒重，稱量得PHA提取量。

1.2.4 鑒定

制涂片進(jìn)行革蘭氏染色以及芽孢染色，顯微鏡下觀察菌體大小、形態(tài)以及有無芽孢生成。

2 結(jié)果

2.1 初篩

菌落呈現(xiàn)黃綠色，黃色和橙色熒光色。根據(jù)熒光色的差異分得11株純培養(yǎng)物，接種至斜面培養(yǎng)基上，4℃低溫保存。

2.2 復(fù)篩

菌體外圍泛紅，菌體內(nèi)部可見明顯的藍(lán)黑色顆粒的菌株可能是產(chǎn)生 PHA的細(xì)菌。

2.3 胞內(nèi)產(chǎn)物提取率

根據(jù)PHA提取率（%）=Wp：Wc=（PHA 提取量/CDW）×100%[5]計算各產(chǎn)物的提取率。菌株H2-5的胞內(nèi)產(chǎn)物產(chǎn)率最高，達(dá)到 36.96%。其次為H2-2，提取率為27.32%，具體結(jié)果見表1。

2.4 鑒定結(jié)果

菌株H2-5的菌落呈圓形，表面光滑，大小均一，邊緣整齊，菌落潮濕呈淡黃色，半透明。革蘭氏染色結(jié)果表明菌株 H2-5 為革蘭氏陰性菌，菌體形狀為桿狀，無莢膜，不形成芽孢。

3 結(jié)束語

聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是可以由很多細(xì)菌合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要作為細(xì)胞內(nèi)碳源貯藏性物質(zhì)而存在，因而具有廣泛應(yīng)用的價值[6]。本研究采用尼羅藍(lán)熒光初篩、蘇丹黑染色復(fù)篩進(jìn)行聚羥基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選，擴(kuò)大了菌株資源，并獲得一株新菌株，為進(jìn)一步開發(fā)PHA的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，我們還對菌株H2-5進(jìn)行了生理生化實驗、并繪制生長曲線。結(jié)果與文獻(xiàn)[7]所述一致，均表明菌株H2-5不能水解利用淀粉作為碳源，也不能利用檸檬酸鹽，且適應(yīng)期短，生長快速，接種18h左右就可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。對提取菌株H2-5基因組DNA進(jìn)行16S rDNA 基因擴(kuò)增測序，結(jié)果表明H2-5為根瘤菌屬。

參考文獻(xiàn)

[1]張圓，孫雪南，陳邦，等.利用微生物混合培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)聚羥基烷酸（PHA）研究[J].微生物學(xué)報，2003，43（006）：799-804.

[2]YilmazM，Soran H，Beyatli Y.Determination of poly-B-hydroxybutyrate（PHB）production by someBacillusspp.World Journal of M-icrobiology& Biotechnology，2005，21： 565-56.

[3]Ganduri V，Ghosh S，Patnaik P. Mixing control as a device to increase PHB production in batch fermentations with cocultures of Lactobacillus delbrueckii and Ralstonia eutropha[J].Process Biochemistry，2005，40： 257-264.

[4]堵國成，陳堅.真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌積累聚-β-羥基丁酸發(fā)酵條件的研究[J].生物工程學(xué)報，2000，16（1）：103-107.

[5]Shang L，Jiang M，Chang H. Poly（ 3-hydroxybutyrate） synthesis in fed-batch culture of Ralstonia eutropha with phosphate limitation under different glucose concentrations[J].Biotechnology Letters，2003，25： 1415-1419.

[6]Mooibroek H，Oosterhuis N，Giuseppin M，et al. Assessment of technological options and economical feasibility for cyanophycin biopolymer and high-value amino acid production[J].Applied microbiology and biotechnology，2007，77（2）： 257-267.

[7]Klemm D，Heublein B，F(xiàn)ink HP，et al. Cellulose： fascinating biopolymer and sustainable raw material[J].Angewandte Chemie International Edition，2005，44（22）：3358-3393.