余華星 李代禧 胥 義 劉 立 翟 振 張 燕

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海 200093)

在對關(guān)節(jié)軟骨進行低溫保存時，常常會觀察到低溫斷裂現(xiàn)象[1-3]，然而其生物力學性能的低溫損傷機理至今仍不甚明確[4]。從現(xiàn)有文獻來看，有關(guān)細胞低溫保存凍結(jié)損傷影響機制的研究，主要集中在懸浮細胞領(lǐng)域，研究方法比較成熟。對于懸浮細胞，由于在冰晶生成時，細胞可以自由移動[5]，胞外冰晶對細胞的損傷程度比對粘附細胞的損傷小，此時胞內(nèi)冰對細胞的損傷起主導作用。然而黏附細胞(包括組織內(nèi)的細胞)是固定的，生成的冰晶與其剛性接觸產(chǎn)生擠壓、剪切作用較大，其受到胞外冰機械損傷增加，甚至更為嚴重[6]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)主導了軟骨細胞的生物力學特性，軟骨細胞的外基質(zhì)生物力學特性的改變可能會改變軟骨細胞的應(yīng)力，應(yīng)變環(huán)境[7]。關(guān)于胞外冰晶對黏附細胞的研究目前還較少，所以胞外冰晶對細胞機械損傷的檢測和研究對解釋組織細胞的低溫損傷機理是非常必要的。文獻[4]利用熱機械分析儀研究了豬軟骨在凍結(jié)過程的熱膨脹行為和熱應(yīng)變值,認為關(guān)節(jié)軟骨至今不能成功保存的重要原因是在低溫凍結(jié)時，關(guān)節(jié)軟骨中存在非均勻熱膨脹現(xiàn)象，從而導致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部產(chǎn)生熱應(yīng)力，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。同時提出了在一定降溫速率下，添加適宜的冷凍保護劑有利于保護關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學性能。

本文采用降溫梯度為1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的慢速降溫方式，通過分別添加四種醇類低溫保護劑，系統(tǒng)考察軟骨低溫保存過程中細胞外發(fā)生的生物力學性能變化，研究降溫速率和低溫保護劑對軟骨在凍結(jié)過程熱膨脹行為的影響情況，希望為工程化軟骨組織的低溫保存提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取上海本地成年豬身上的整根有兩瓣半月板覆蓋的白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去，選取受力負荷相對集中的中央軟骨，用專用采樣工具制備直徑為5 mm厚度為3～4 mm的軟骨測試樣品。本實驗為了便于討論，采用摩爾濃度標定保護劑，從而減小了分子量差異對實驗結(jié)果的影響。因為高濃度保護劑的添加存在玻璃化現(xiàn)象，并且會對關(guān)節(jié)軟骨細胞以及其他活性物質(zhì)造成不可逆損傷[4]，實驗采用較小摩爾濃度(1.5 mol/L、4.5 mol/L)的乙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、甘油(四種試劑均為分析純，購置于上海國藥集團化學試劑有限公司)，分別進行2.5 h的充分滲透并放在4 ℃冰箱貯存以備實驗時取用。

1.2 實驗方法

使用熱機械分析儀 (TMA Q400, TA, USA) 作為測試儀器(壓縮模式)。測試方法如下：將樣品置于壓縮夾具中心位置；加載0.005N的微小載荷，讀取此時樣品的厚度為初始厚度。針對黏附成骨細胞的前期實驗結(jié)果表明[8-10]，在慢速降溫時沒有胞內(nèi)冰的生成，即胞外水分凍結(jié)膨脹所致的熱應(yīng)力是軟骨組織內(nèi)部損傷的主要因素。因此，本實驗選擇分別以1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的降溫速率從0 ℃開始程序降溫至-60 ℃，并記錄整個過程樣品的熱應(yīng)變曲線。通過最終分析該熱應(yīng)變曲線，研究關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程的低溫損傷機理和低溫保護劑對關(guān)節(jié)軟骨的低溫保護機理。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 降溫速率對凍結(jié)過程熱膨脹的影響

2.1.1降溫速率對添加乙醇、乙二醇的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

添加乙醇和乙二醇時，在不同降溫速率和濃度作用下，豬軟骨的低溫熱流曲線如圖1所示，其中曲線相對應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值見表1。

表1 添加乙醇和乙二醇時不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

圖1表明，添加乙醇和乙二醇保護劑時，降溫速率對關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程的熱膨脹有非常顯著的影響。結(jié)合表1及圖1(a)、(c)可以發(fā)現(xiàn)，當添加乙醇、乙二醇濃度為1.5 mol/L時，樣品在三種降溫速率下，3 ℃/min時的熱應(yīng)變變化值是最小的?？赡苁且驗樵诮禍剡^程中， 細胞外局部結(jié)冰，細胞內(nèi)未結(jié)冰處于過冷狀態(tài)，水分開始滲出細胞，導致細胞外的冰晶不斷生長。在濃度為1.5 mol/L時，由于保護劑濃度較低，滲透進入軟骨組織的保護劑分子較少，其對水分子的結(jié)合作用較弱，所以胞內(nèi)有大量的自由水可以外滲。當降溫速率較快時，胞外水的過冷度高，突然結(jié)晶導致膨脹應(yīng)力來不及釋放，然而此時細胞內(nèi)的水來不及外滲，因此冰晶的生長有限；降溫速率較慢時，雖然冰晶的成核率較低，胞外基質(zhì)對應(yīng)力具有一定的緩沖作用，然而隨著胞內(nèi)水分不斷外滲，冰晶不斷生長增大，總體應(yīng)變變化值依舊較大。因此，當降溫速率為3 ℃/min時，存在最佳降溫速率，胞內(nèi)水外滲不致過多，細胞外冰的生長又不至于過快，胞外蛋白具有一定的緩沖作用，膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力得以及時釋放。

由圖1(b)、(d)可以看出，對于添加濃度為4.5 mol/L保護劑的豬軟骨，降溫速率越快，其熱應(yīng)變變化值越大。此時，保護劑濃度相對較高，滲透進入軟骨細胞的保護劑分子較多，其對水分子的結(jié)合作用較強，胞內(nèi)水的外滲作用對于整個組織的膨脹效應(yīng)貢獻已經(jīng)不大，胞外自身水膨脹應(yīng)力對于整個組織的膨脹起主導作用。軟骨胞外基質(zhì)中存在大量的膠原和蛋白多糖，對冰晶的膨脹效應(yīng)具有緩沖效應(yīng)。隨著降溫速度的增加，胞外基質(zhì)來不及調(diào)整形態(tài)，導致由于膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力來不及釋放。

圖1 乙醇和乙二醇保護下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

2.1.2降溫速率對添加乙1,2-丙二醇和甘油的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

添加1,2-丙醇和甘油時，不同降溫速率和濃度作用下，豬軟骨的低溫熱應(yīng)變曲線如圖2所示，其中曲線相對應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值列于表2。

通過圖2發(fā)現(xiàn)，丙二醇以及甘油在濃度為1.5 mol/L時，應(yīng)變隨溫度的變化情況與乙醇及乙二醇相同。然而在濃度為4.5 mol/L時依舊存在最佳降溫速度，即3 ℃/min時，豬軟骨應(yīng)變最小。出現(xiàn)這種情況的最可能原因是三碳醇對水的結(jié)合性更優(yōu)，此時軟骨熱應(yīng)力的大小主要取決于冰晶自身的形成機制。原因可以用結(jié)晶理論來解釋：慢速降溫的成核率較低，而冰晶生長快，生成少但較大的冰晶；快速降溫的成核率高，但冰晶生長慢，因而生成多但較小的冰晶[11]。二者的拮抗作用結(jié)果為存在最佳降溫速度，使得此時的冰晶形成率最低。

由圖1、2可以看出，在凍結(jié)相變發(fā)生前的熱應(yīng)變首先快速減小，隨著降溫速率的增大，熱收縮幅度越小。原因是在凍結(jié)發(fā)生前，關(guān)節(jié)軟骨中的水分子雖然受降溫的影響而縮短彼此間的距離，在當快速降溫時，達到凍結(jié)相變點溫度的時間短，水分子之間的距離還沒有來得及減小到穩(wěn)定狀態(tài)，就發(fā)生了凍結(jié)相變過程，因而凍結(jié)發(fā)生前的熱收縮越小[4]；還能發(fā)現(xiàn)保護劑濃度為4.5 mol/L時，膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力要顯著小于1.5 mol/L。其主要原因有兩個方面：一是高濃度低溫保護劑(溶質(zhì))占據(jù)了本該參與相變的純水份額較多，二是有一部分水與低溫保護劑之間以氫鍵的形式相聯(lián)系，成為不凍水(未凍水)。未凍水含量的高低反映了保護劑結(jié)合水能力的強弱[12]。

表2 添加1,2-丙醇和甘油時不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

圖2 1,2-丙二醇和甘油保護下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

2.2 低溫保護劑對凍結(jié)膨脹的影響

圖3給出了樣品經(jīng)過乙醇、乙二醇、1,2-丙醇、甘油處理后的凍結(jié)過程熱應(yīng)變變化情況(降溫速率3 ℃/min)。從圖中不難發(fā)現(xiàn)，與其他三種醇類相比，1,2-丙二醇的保護效果最優(yōu)。其可能原因是在物質(zhì)的量濃度相同的情況下，1,2-丙二醇也要強于其他三種醇類，這與胡桐記等[13]使用DSC研究不同醇類水和性質(zhì)的研究結(jié)果一致。Fahy等[14]認為諸多低溫保護劑結(jié)合水能力的高低，除了部分與本身所含有的羥基個數(shù)有關(guān)，還與是否含有甲基以及甲基的個數(shù)有關(guān)，這就是所謂的“甲基化效應(yīng)”。甲基的存在降低了羥基之間鍵合的可能性，切斷了溶質(zhì)之間羥基鏈的鍵合，增大了與水分子之間鍵合的可能性[15]。由于甘油分子中有較長的羥基鏈，大大增加了保護劑自身或者保護劑之間的鍵合的概率，從而弱化了對水束縛的能力，造成了結(jié)合水能力弱于1,2-丙二醇，同樣的道理適用于乙二醇和甘油的比較。在1,2-丙二醇和乙二醇的比較中，1,2-丙二醇的結(jié)合水能力也是強于乙二醇，兩者的分子中雖然都只有兩個羥基基團，但是1, 2-丙二醇分子中多了一個碳原子，減少了保護劑之間的鍵合的概率，使得1,2-丙二醇自身鍵合的概率降低，與水鍵合的可能性也就增加了。

圖3 3 ℃/min的降溫速率下四種保護劑不同濃度下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

3 結(jié)論

1) 關(guān)節(jié)軟骨低溫凍結(jié)保存時，細胞外存在熱膨脹現(xiàn)象，導致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部熱應(yīng)力的產(chǎn)生，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。影響該熱應(yīng)力大小的因素有很多，如降溫速率，添加保護劑的濃度和種類。

2) 降溫速率對胞外膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力的影響機制復雜：隨著速度的增加，未凍水的過冷度增加，成核率較高，保外基質(zhì)難以起到緩沖效果，導致膨脹熱應(yīng)力較大；然而此時，胞內(nèi)水的外滲作用弱，未凍水含量較少，同時冰晶的生長速率也較低。一定濃度冷凍保護劑的添加，可以影響降溫過程的主導因素，進而找到最佳降溫速率。

3) 由于甲基對于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學性能保護要好于羥基，與乙醇、乙二醇、甘油相比，1,2-丙二醇更適合保護關(guān)節(jié)軟骨。

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