解麗芳， 林宏輝

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 四川 成都 610065)

0 引 言

2010 年3 月， 國(guó)家教育部啟動(dòng)基于基礎(chǔ)學(xué)科拔尖創(chuàng)新人才的“國(guó)家拔尖人才培養(yǎng)計(jì)劃”，并率先在清華大學(xué)、北京大學(xué)、四川大學(xué)等全國(guó)11所高校試點(diǎn)。我校根據(jù)自己的學(xué)科優(yōu)勢(shì)，將生物作為學(xué)科率先試點(diǎn)之一。每年選拔15～20名學(xué)生進(jìn)入拔尖人才班，并使用淘汰制，對(duì)學(xué)生進(jìn)行動(dòng)態(tài)化管理。

針對(duì)拔尖班學(xué)生的培養(yǎng)，除了學(xué)院配備高水平專家、學(xué)者以及允許學(xué)生進(jìn)入國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)外學(xué)習(xí)外。我中心作為對(duì)拔尖班學(xué)生進(jìn)行基本技能培訓(xùn)的重要基地，根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件，并綜合考慮拔尖人才培養(yǎng)需要，設(shè)立了專門的模式生物實(shí)驗(yàn)室，將模式生物-斑馬魚引入中心。旨在通過(guò)借助拔尖人才培養(yǎng)的契機(jī)，開拓本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)新領(lǐng)域，并將拔尖人才培養(yǎng)獲得的經(jīng)驗(yàn)推廣應(yīng)用至全體本科生培養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣斑馬魚的可行性

斑馬魚作為生命科學(xué)研究中最重要的脊椎動(dòng)物模式生物之一，在多門學(xué)科中得到廣泛應(yīng)用，并不斷涌現(xiàn)新的研究成果[1-2]。為滿足創(chuàng)新人才培養(yǎng)需要，我中心將斑馬魚引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)當(dāng)中，那么將這種模式生物引入本科生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)當(dāng)中是否可行呢？

1.1 斑馬魚的優(yōu)點(diǎn)及研究現(xiàn)狀

斑馬魚作為一種新興的模式生物，屬于脊椎動(dòng)物，與人類基因有85%相似，因其具有繁殖周期短、易于飼養(yǎng)、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、體外發(fā)育速度快、實(shí)驗(yàn)體系比較完善、精子可以冷凍保存等優(yōu)點(diǎn)[3-5]，斑馬魚已經(jīng)成為模式生物家族中重要的一員,受到越來(lái)越多的重視和利用。目前斑馬魚被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、人類疾病研究、神經(jīng)科學(xué)、遺傳學(xué)、 腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、毒理與環(huán)保等方面的研究中[6-8]。

隨著斑馬魚技術(shù)的日趨成熟，國(guó)內(nèi)也建立了多個(gè)斑馬魚實(shí)驗(yàn)室，目前我國(guó)已有250個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室利用斑馬魚開展有關(guān)科研工作，并且成立了“國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃斑馬魚資源中心”[9]。

1.2 擁有完善的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)

隨著斑馬魚研究技術(shù)日益成熟，逐步建立起來(lái)了非常完善的斑馬魚數(shù)據(jù)庫(kù)，常用的有：① 斑馬魚模式物種綜合數(shù)據(jù)庫(kù)ZFIN，是斑馬魚的核心數(shù)據(jù)庫(kù)。收集的信息主要可分為斑馬魚基因信息、相關(guān)資源、基因組圖譜和作圖相關(guān)信息、研究工作信息、組織結(jié)構(gòu)的解剖學(xué)定義、品系和基因命名規(guī)范等工作，是斑馬魚研究工作者最主要的信息平臺(tái)。② 基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)Ensembl,該數(shù)據(jù)庫(kù)是由歐洲生物信息研究所和英國(guó)sanger研究所共同維護(hù)的一個(gè)脊椎動(dòng)物基因組自動(dòng)注釋平臺(tái)，斑馬魚是其三大核心物種之一。③ 其他斑馬魚常用的物種通用數(shù)據(jù)庫(kù)包括Vega 、UCSC Genome Browser、核酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank / EMBL /DDBJ、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt等[10-12]。

1.3 利用已有條件，快速建立斑馬魚實(shí)驗(yàn)室

建立斑馬魚實(shí)驗(yàn)室所需的儀器設(shè)備，如：PCR儀、高速低溫離心機(jī)、超低溫冰箱(-80℃)、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度儀、熒光倒置顯微鏡等在一般的本科生物教學(xué)實(shí)驗(yàn)室都具備，因此只需在此基礎(chǔ)上購(gòu)置斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，或者直接自制簡(jiǎn)易的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，就可以建設(shè)完善的本科生斑馬魚創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室。

1.4 開設(shè)適合本科生學(xué)習(xí)的綜合性、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

斑馬魚相關(guān)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，例如：基因過(guò)表達(dá)，基因敲除、原位雜交、時(shí)間表達(dá)譜建立等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均非常適合在本科生中開設(shè)，這些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涉及斑馬魚飼養(yǎng)、斑馬魚繁殖、分子克隆、無(wú)RNA酶(RNAase)操作等實(shí)驗(yàn)技術(shù)?？梢院芎玫劐憻拰W(xué)生的綜合能力及創(chuàng)新能力。

2 我中心開展斑馬魚相關(guān)實(shí)驗(yàn)的情況

我中心在人才培養(yǎng)過(guò)程中，注重對(duì)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)、創(chuàng)新精神、創(chuàng)新能力、團(tuán)隊(duì)協(xié)作等多方面素質(zhì)的培養(yǎng)。因此在實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目選擇過(guò)程中，更注重實(shí)驗(yàn)的綜合性、創(chuàng)新性，并兼顧可行性。作為一種模式生物，雖然斑馬魚在科研領(lǐng)域的應(yīng)用已非常廣泛，但是在本科教學(xué)中的應(yīng)用還相對(duì)較少。為了更好的滿足我中心對(duì)創(chuàng)新人才培養(yǎng)的需求，同時(shí)考慮到斑馬魚在養(yǎng)殖和研究方面的優(yōu)勢(shì)，在中心原有實(shí)驗(yàn)設(shè)備的基礎(chǔ)上，我們建立了一個(gè)小型的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室建設(shè)完成之后，我們根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)條件以及課程設(shè)置情況，面向拔尖班學(xué)生開設(shè)了斑馬魚相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。這些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均符合創(chuàng)新性、綜合性的要求。以下就對(duì)這些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目作一些簡(jiǎn)單的介紹：

2.1 斑馬魚養(yǎng)殖與繁殖

斑馬魚作為一種模式生物，養(yǎng)殖條件簡(jiǎn)單，繁殖速度快，是它最主要的兩大優(yōu)勢(shì)，這也是我們將斑馬魚引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的主要原因。為了加深學(xué)生對(duì)斑馬魚的認(rèn)識(shí)和了解，同時(shí)也為了鍛煉學(xué)生的自我動(dòng)手能力。我們一改往日教師為學(xué)生準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料的教學(xué)方法，要求學(xué)生自己對(duì)斑馬魚進(jìn)行養(yǎng)殖，對(duì)斑馬魚從產(chǎn)卵開始一直到發(fā)育到成魚的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行追蹤。通過(guò)這個(gè)過(guò)程的學(xué)習(xí)，一方面學(xué)生可以掌握斑馬魚養(yǎng)殖技術(shù)，了解斑馬魚胚胎各個(gè)發(fā)育時(shí)期的特點(diǎn)，同時(shí)也能夠鍛煉學(xué)生的自主動(dòng)手能力，為學(xué)生以后獨(dú)立進(jìn)行科研工作奠定基礎(chǔ)。

2.2 斑馬魚發(fā)育相關(guān)基因原位雜交實(shí)驗(yàn)

原位雜交技術(shù)是斑馬魚基因功能研究中一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，該方法主要包括：PCR擴(kuò)增，克隆完整的開放閱讀框架；瓊脂糖凝膠電泳及擴(kuò)增片斷的膠回收；感受態(tài)細(xì)胞的制備及T-A克?。惑w外轉(zhuǎn)錄合成探針；原位雜交等多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以了解和掌握分子克隆、體外轉(zhuǎn)錄、細(xì)菌接種、細(xì)菌傳代、RNA free操作技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的學(xué)習(xí)，可以很好地培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維方式，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性[13]。

2.3 斑馬魚發(fā)育相關(guān)基因時(shí)間表達(dá)譜構(gòu)建實(shí)驗(yàn)

斑馬魚發(fā)育相關(guān)基因時(shí)間表達(dá)譜構(gòu)建實(shí)驗(yàn)，在科研活動(dòng)中經(jīng)常與斑馬魚發(fā)育相關(guān)基因原位雜交實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用，通過(guò)這兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的相輔相成，可以快速獲取未知基因時(shí)空表達(dá)譜，了解目的基因的表達(dá)是否具有組織特異性，從而推測(cè)基因可能的功能[14-15]。

該實(shí)驗(yàn)主要涉及：發(fā)育相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)；PCR擴(kuò)增，克隆完整的開放閱讀框架；瓊脂糖凝膠電泳及擴(kuò)增片斷的膠回收；感受態(tài)細(xì)胞的制備及T-A克??；斑馬魚早期發(fā)育各時(shí)期胚胎收集；各發(fā)育時(shí)期胚胎總RNA提??；用RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)期的基因表達(dá)水平；瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果等步驟。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的學(xué)習(xí)，學(xué)生可以掌握引物設(shè)計(jì)、分子克隆、細(xì)菌接種、細(xì)菌傳代、總RNA提取、RT-PCR、RNA free操作技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在學(xué)生中開設(shè)之后，取得了很好的教學(xué)效果。

2.4 TGF-β對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

該實(shí)驗(yàn)利用小分子化合物SB-431542可以對(duì)Nodal信號(hào)的Ⅰ受體發(fā)揮阻斷作用的特性，收集不同發(fā)育時(shí)期的胚胎，用SB-431542進(jìn)行處理，阻斷Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使胚胎出現(xiàn)類似突變體MZoep或Zoep的表型，觀察Nodal信號(hào)通路對(duì)中胚層發(fā)育的影響，使學(xué)生了解細(xì)胞信號(hào)通路在細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中的重要作用。

該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主要涉及斑馬魚繁殖、不同發(fā)育時(shí)期胚胎收集、SB- 431542處理各發(fā)育時(shí)期細(xì)胞、顯微觀察等過(guò)程。在我中心以往的教學(xué)過(guò)程中，沒(méi)有開設(shè)有關(guān)信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，學(xué)生對(duì)信號(hào)通路的了解更多地是一種空洞的想象，通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)，可以使學(xué)生更直觀了解信號(hào)通路的相關(guān)知識(shí)。

3 結(jié) 語(yǔ)

斑馬魚作為發(fā)育生物學(xué)的重要模式生物之一，因其多方面的優(yōu)點(diǎn)，在科學(xué)研究中受到越來(lái)越多的關(guān)注。并且由于其作為一種脊椎動(dòng)物，與人類基因具有高度同源性，更是增加了科研工作者對(duì)其的研究熱情，以斑馬魚為材料的研究成果越來(lái)越多，并因此加深了對(duì)脊椎動(dòng)物發(fā)育機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

我中心響應(yīng)教育部號(hào)召，重視人才創(chuàng)新精神、創(chuàng)新意識(shí)、創(chuàng)新精神、創(chuàng)新能力、團(tuán)隊(duì)協(xié)作等多方面素質(zhì)的培養(yǎng)?？紤]到中心的設(shè)備與人員優(yōu)勢(shì)，將斑馬魚這種熱門的模式生物引入了本科拔尖人才實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，并設(shè)置了一系列以斑馬魚為研究對(duì)象的創(chuàng)新性、綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。在為拔尖班學(xué)生開設(shè)過(guò)程中，拓展了學(xué)生的知識(shí)面，使學(xué)生了解了以前沒(méi)有接觸過(guò)的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)學(xué)生創(chuàng)新能力、自主能力、協(xié)作能力起到了很好的培養(yǎng)效果。

[1] 喻俊磊.斑馬魚在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,24(3):108 -110.

YU Jun -lei.Application of Zebra Fish in Life Sciences[J]. Research Acta Agriculturae Jiangxi, 2012,24(3):108 -110.

[2] 李 禮,羅凌飛.以斑馬魚為模式動(dòng)物研究器官的發(fā)育與再生[J].遺傳,2013, 35(4):421-432.

LI Li, LUO Ling-Fei.Zebrafish as the model system to study organogenesis andregeneration[J].Hereditas (Beijing) ,2013, 35(4):421-432.

[3] 孫智慧,賈順姬,孟安明.斑馬魚: 在生命科學(xué)中暢游[J].生命科學(xué),2006,18(5):431-436.

SUN Zhi-Hui, JIA Shun-Ji, MENG An-Ming.Zebrafish: swimming in life sciences [J].Chinese Bulletin of Life Sciences,2006,18(5):431-436.

[4] 劉昌盛,穆 宇,杜久林.斑馬魚在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2007,19(4):382-386.

LIU Changsheng, MU Yu, DU Jiulin.Application of the zebrafish in the research of life sciences[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2007，19(4)：382-386.

[5] 鄭乃中,張 博.斑馬魚精子凍存與復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)方法與流程[J].遺傳,2012, 34(9):1211-1216.

ZHENG Nai-Zhong,ZHANG Bo.A brief protocol for sperm cryopreservation and revival in zebrafish[J].Hereditas (Beijing), 2012, 34(9):1211-1216.

[6] 耿 波,曹頂臣,孫效文.斑馬魚-新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2006(2):105-108.

GENG bo,CAO Ding-chen,SUN Xiao-wen.zebrafish -a new type of experimental animal[J]. Chinese Journal of Ftsheries,2006(2):105-108.

[7] 牛榮麗,閻 松,杜長(zhǎng)青.抗腫瘤新藥的新型模式生物斑馬魚[J].新藥研究雜志,2006,15(7):496-500.

NIU Rong-li,YAN Song,DU Chang-qing.Zebrafish:a new model for anti-cancer agents [J].Chinese Journal of New Drugs. 2006,15(7):496-500.

[8] 邵潘柱,林金杏,胡建華.斑馬魚實(shí)驗(yàn)室繁育方法研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(14):6282- 6284.

SHAO Pan-zhu,LIN Jin-xing,HU Jian-hua.The Laboratory Breeding Methods of Zebrafish ( Danio rerio) [J].Journal of Anhui Agri,2013,41(14):6282- 6284.

[9] 孫永華.國(guó)家斑馬魚資源中心簡(jiǎn)介[J].遺傳,2013,35(4):549-550.

SUN Yong-hua.The Introduction of the National Resource Center of Zebrafish[J]. Hereditas (Beijing). 2013,35(4):549-550.

[10] 李輝輝,黃 萍,董 巍.斑馬魚研究走向生物醫(yī)學(xué)[J].遺傳,2013,35(4): 410-420.

LI Hui-Hui,HUANG Ping,DONG Wei.A brief history of zebrafish research——toward biomedicine[J].Hereditas (Beijing). 2013,35(4): 410-420.

[11] 肖 安,張 博.斑馬魚核心數(shù)據(jù)庫(kù)簡(jiǎn)介[J].遺傳,2013,35(4):545-546.

Xiao An,ZHANG Bo.Brief introduction of zebrafish core database[J].Hereditas (Beijing). 2013.35(4):545-546.

[12] 肖 安,張雨田,張 博.斑馬魚研究計(jì)劃與相關(guān)資源簡(jiǎn)介[J].遺傳,2013,35(4): 547-548.

XIAO An,ZHANG Yu-tian,ZHANG Bo. Introduction of zebrafish study plan and related resources[J]. Hereditas (Beijing). 2013,35(4): 547-548.

[13] 解麗芳,楊 軍,林宏輝. 在拔尖人才教學(xué)中開設(shè)斑馬魚原位雜交實(shí)驗(yàn)探索[J].生物學(xué)雜志,2012,29 (4): 96-98.

XIE Li-fang,YANG Jun,LIN Hong-hui. The exploration of in situ hybridization of zebrafish in top-notch talent teaching[J]. Journal of Biology,2012.29 (4): 96-98.

[14] 楊雪艷,姚紀(jì)花,成 璐. 斑馬魚整胚原位雜交和顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立(簡(jiǎn)報(bào))[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),2003,36(3):243-245.

YANG Xue-yan,YAO Ji-hua,CHENG Lu.The establishment of zebrafish embryo in situ hybridization and microinjection transgenic technology (Bulletin) [J].Acta Biologiac Experimentalis Sinica. 2003,36(3):243-245.

[15] 何玉英,李 健,劉 萍.原位雜交技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2005,26(1):74-79.

HE Yu-ying, LI Jian, LIU Ping.In situ hybridization technique and the applications in aquaculture[J]. Marine Fisheries Research,2005,26(1):74-79.