孫輝 綜述，孫濤 審校

海軍總醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100048

20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)riedenstein 等第一次將大鼠骨髓來源的骨髓成祖細(xì)胞定義為間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）[1]。MSC 可來源于骨髓、脂肪、血、肺、臍帶、臍血、胎盤等組織，多項(xiàng)研究均表明在適宜環(huán)境下MSC 可分化成內(nèi)胚層、中胚層，甚至外胚層細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌、軟骨細(xì)胞、平滑肌、肌腱細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力，同時(shí)可以向外胚層的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島素分泌細(xì)胞等分化。其跨系、甚至跨胚層橫向分化的可塑性及強(qiáng)大的分化潛能使它適用于組織修復(fù)。MSC還可逃避免疫識(shí)別，抑制免疫反應(yīng)，所以被稱為免疫原性細(xì)胞。因此，MSC 在細(xì)胞再生和免疫調(diào)節(jié)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 基因修飾技術(shù)及修飾后MSC的優(yōu)越性

基因修飾主要是指利用生物化學(xué)方法修改DNA 序列，將目的基因片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或者將特定基因片段從基因組中刪除，從而達(dá)到改變宿主細(xì)胞基因型或使得原有基因型得到加強(qiáng)的作用。修飾基因一旦導(dǎo)入細(xì)胞，即可超表達(dá)特定基因或構(gòu)建的基因，不斷合成特定蛋白質(zhì)，使其對(duì)高血糖、激素濃度或藥物、化學(xué)因素等生理刺激反應(yīng)更敏感。

相比其他成體干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等）而言，MSC 具有明顯的營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)特性，更適用于治療退行性疾病。據(jù)報(bào)道，靜脈注射MSC 已成功治療移植物抗宿主病、成骨不全等多種系統(tǒng)性疾病，Wakitani 等發(fā)現(xiàn)已有多例使用MSC 治療軟骨不全的成功臨床案例[2]。原始或基因修飾的MSC 也可應(yīng)用于肝臟、心肌、神經(jīng)、骨、肌腱及其他結(jié)締組織的再生中。對(duì)于除器官移植再無其他治療方法的疾病，MSC 移植無疑讓患者看到了曙光。但原始MSC植入宿主后有存活時(shí)間短、損傷部位聚集濃度低等缺點(diǎn)，而基因修飾的MSC 能克服以上缺陷。通過優(yōu)化干細(xì)胞和載體選擇，在MSC 內(nèi)有效導(dǎo)入特定基因，并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證修飾后的MSC 表達(dá)蛋白的能力，將其應(yīng)用于臨床，可治療獲得性和遺傳性疾病。

2 基因修飾的MSC的臨床應(yīng)用

2.1 人工肝

據(jù)研究，在分離培養(yǎng)的早期肝細(xì)胞中加入曲古柳菌素A（trichostatin A，TSA）后可阻斷細(xì)胞周期的G0/G1，以維持肝細(xì)胞功能[3]。因此，在人MSC（hMSC）內(nèi)預(yù)先注入1μL TSA，并用肝源刺激因子預(yù)處理6 d，即可分化成顯型且功能特點(diǎn)與原始肝細(xì)胞類似的細(xì)胞[4]，特別是當(dāng)加入基因調(diào)節(jié)劑組蛋白去乙酰化酶抑制劑時(shí)，就可促進(jìn)肝源祖細(xì)胞分化成全能肝細(xì)胞。一般情況下，基因調(diào)節(jié)劑可影響細(xì)胞進(jìn)程的多個(gè)階段（細(xì)胞周期、分化、凋亡等），因此，通過基因修飾可有效培養(yǎng)早期肝細(xì)胞。鑒于以上原理和事實(shí)，基因修飾對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要，在此過程中，導(dǎo)入時(shí)機(jī)、計(jì)量和環(huán)境條件是主要影響因素[5]。

2.2 糖尿病

胰腺移植是目前治愈1 型糖尿病的惟一方法，胰腺供體的匱乏，大大促進(jìn)了細(xì)胞替代療法的發(fā)展。MSC 的組織再生和免疫調(diào)節(jié)特性，可促進(jìn)血管生成、胰腺β細(xì)胞再生和避免移植排斥反應(yīng)，結(jié)合現(xiàn)已取得的基因療法的研究成果，基因修飾后的MSC進(jìn)一步發(fā)揮原始MSC 的治療優(yōu)勢(shì)，重獲干細(xì)胞樣特性。通過基因修飾或改變培養(yǎng)環(huán)境，來源于胰腺、骨髓、脂肪、臍帶等組織的MSC 有分化成胰島素分泌細(xì)胞（insulin-producing cells，IPC）的潛能，因此MSC為胰島移植提供了另一種β細(xì)胞的來源。Li 等[6]在體外實(shí)驗(yàn)中，通過腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Pdx1（pancreatic duodenum homeobox protein-1）到hMSC 內(nèi)，可誘導(dǎo)其分化成功能性IPC，還可表達(dá)多種胰島細(xì)胞基因（neurogenin 3 因子、胰島素、半乳糖激酶、胰高血糖素），在葡萄糖調(diào)節(jié)模式中釋放胰島素或C 肽。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，移植Pdx1 基因修飾的hMSC 到鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，可促進(jìn)胰島再生，2 周內(nèi)小鼠血糖就可達(dá)到正常水平，并維持至少42 d，并在受體腎小囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)了可表達(dá)胰島素的移植細(xì)胞。因此，基因修飾的hMSC可作為治療糖尿病的新方法。

2.3 心梗

近十年，關(guān)于MSC 的研究越來越多，尤其在心梗的治療中，MSC的可塑性、歸巢和炎性調(diào)節(jié)特性對(duì)因動(dòng)脈堵塞引起的心肌缺血損傷有良好的修復(fù)作用。基因修飾的MSC 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管生成，并分泌更多的生長因子以修復(fù)心肌功能，通過基因修飾加強(qiáng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞活素或其受體的表達(dá)，可使其在梗死心肌有效存活、歸巢和動(dòng)員。MSC 超表達(dá)的CXCR4 與其配體SDF-1 結(jié)合后可增強(qiáng)移植和再生能力，并促進(jìn)心肌壁的血管生成，降低膠原Ⅰ/Ⅲ比率以減少重塑[7-8]。類似地，SDF-1 超表達(dá)的MSC可保護(hù)受體心肌細(xì)胞并提供營養(yǎng)支持。相比于原始MSC 移植，超表達(dá)CXCR-4和SDF-1 的MSC 在治療冠脈閉塞再灌注損傷小鼠時(shí)有更強(qiáng)的遷移、局限和治療作用。據(jù)Noiseux 等的研究[9]，用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的Akt 超表達(dá)的鼠MSC 注入心梗模型鼠梗死區(qū)域后，追蹤標(biāo)記的GFP 早達(dá)3 d 就出現(xiàn)MSC 與受體心肌細(xì)胞融合的現(xiàn)象。據(jù)此，可見MSC是目前心梗治療的新希望。

2.4 腦卒中

細(xì)胞替代療法是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新選擇，Kim 等[10]發(fā)現(xiàn)Ngn1 可誘導(dǎo)MSC 分化成神經(jīng)元，分化的細(xì)胞可表達(dá)電壓門控L-型鈣通道和河豚毒素敏感型電壓門控鈉通道，這2 條通道可激發(fā)并傳播神經(jīng)元。Ngn1 基因修飾的MSC 移植入腦卒中大鼠模型顱骨內(nèi)后可促進(jìn)神經(jīng)元間接觸，提高傳導(dǎo)功能。研究還發(fā)現(xiàn)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶修飾hMSC 可用于大鼠腦缺血模型的功能恢復(fù)[11]，修飾后的hMSC 由靜脈注入中腦動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠模型，12 h后觀察發(fā)現(xiàn)腦梗死面積明顯減少，且鼠臨床表現(xiàn)也明顯改善。MSC 還可通過分泌如腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）這類神經(jīng)調(diào)節(jié)分子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和神經(jīng)形成[12]。為進(jìn)一步增強(qiáng)其旁分泌作用，Kurozumi等[13]通過腺病毒載體將BDNF基因整合到hMSC 中，觀察發(fā)現(xiàn)BDNF 的分泌量是未進(jìn)行基因整合的MSC 的23 倍。目前的研究結(jié)果均說明通過不同方式修飾的MSC 作為一種治療腦卒中的新方法，可減少梗死面積并促進(jìn)腦缺血的功能恢復(fù)。

2.5 帕金森病

帕金森病主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA 含量顯著性減少而致病。而MSC 在一定誘導(dǎo)條件下可分化成神經(jīng)細(xì)胞，基因修飾的MSC 更可持續(xù)翻譯出治療性蛋白，用于治療神經(jīng)退化性疾病。早期Schwarz 等[14]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了基因修飾的MSC 治療6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森模型鼠的有效性，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因到MSC內(nèi)，翻譯的TH可使酪氨酸轉(zhuǎn)變成L-多巴，且在鼠紋狀體內(nèi)檢測(cè)到了L-多巴及其代謝產(chǎn)物。以上研究均表明基因修飾的MSC是治療帕金森病的最優(yōu)細(xì)胞治療方案。

2.6 骨骼、肌肉系統(tǒng)疾病

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）修飾的MSC在形成骨和軟骨過程中發(fā)揮重要作用。在骨缺陷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15]及脛骨骨折不愈、脊柱融合術(shù)和骨不連的臨床試驗(yàn)[16]中，均證明了BMP-2 的成骨作用。基因修飾的MSC 不僅可分化成肌肉骨骼細(xì)胞，還可刺激臨近細(xì)胞參與修復(fù)，移植MSC到重度免疫聯(lián)合缺陷的小鼠模型的脛前肌或關(guān)節(jié)中，短期表達(dá)BMP-2 就可有效誘導(dǎo)骨軟骨形成。結(jié)合基因的治療作用更優(yōu)于整合基因，BMP-2/7和BMP-4/7 異二聚體比同型二聚體有更好的活性，同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)BMP-2 或BMP-4和BMP-7 進(jìn)入MSC 的成骨作用是簡單基因整合的2～3 倍[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)過表達(dá)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2可控制MSC的成骨分化[19]，這能夠避免由BMP 過表達(dá)引起的異常成骨?；蛐揎桵SC 是骨軟骨疾病的新型治療方法，且通過調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)可防止成骨的過表達(dá)。

2.7 癌癥

基因修飾的MSC 可在腫瘤靶向治療中發(fā)揮抗腫瘤作用，在癌癥治療方面有不可預(yù)期的前景。研究提出γ干擾素（IFN-β）通過抑制增生、促進(jìn)凋亡起抗癌作用，但I(xiàn)FN-β的抗腫瘤濃度高于人體可耐受的最大劑量，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。為解決此問題，Studeny 等[20-21]通過靜脈注射表達(dá)IFN-β的MSC 到重度免疫聯(lián)合缺陷小鼠體內(nèi)，治療肺多發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤，可見MSC 定位于肺腫瘤組織，抑制肺代謝并延長小鼠生存時(shí)間。Xin 等[22]研究表明，CX3CL1 超表達(dá)的MSC 也可起相同的作用。Nakamizo 等[23]進(jìn)一步研究了表達(dá)IFN-β的MSC治療顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的方案，發(fā)現(xiàn)MSC 定位于神經(jīng)膠質(zhì)瘤部位，亦明顯延長小鼠存活時(shí)間。在Stagg 等[24]的類似研究中，探索了表達(dá)白細(xì)胞介素2（IL-2）的MSC 能否抑制免疫系統(tǒng)正常的低免疫原性B16 黑色素瘤小鼠的免疫反應(yīng)，結(jié)果表明，表達(dá)IL-2 的MSC 與B16 細(xì)胞混合后可抑制腫瘤增生，且抑制作用與IL-2 的劑量成正比，對(duì)腫瘤的抑制率達(dá)90%，有效抑制B16 細(xì)胞的增生；但移植原始MSC 的對(duì)照組不影響腫瘤生長。通過不同方式的基因修飾均可達(dá)到治療癌癥的目的。

3 結(jié)語

臨床上的持久難愈疾病及不斷出現(xiàn)的新危險(xiǎn)因素都給病人及醫(yī)生帶來巨大挑戰(zhàn)，尋找新的治療方法刻不容緩。基因修飾的MSC 在臨床疾病治療中有多潛能作用，通過合適的修飾，增強(qiáng)基因表達(dá)，使移植后的干細(xì)胞在宿主環(huán)境中可以存活更久，并分泌對(duì)病人有利的特定蛋白，起到治療疾病的目的。但將細(xì)胞替代療法應(yīng)用于臨床實(shí)踐是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，目前迫切要解決的問題是如何精確地改良干細(xì)胞，翻譯出特定蛋白質(zhì)，有效用于疾病治療。

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