仵強(qiáng) ，黃竹青，劉芹，王立強(qiáng)，周青陽，王洪軍，吳揚(yáng)，孫艷

1.陜西楊凌天和生物科技有限公司，陜西 楊凌 712100；2.遼寧衛(wèi)生技術(shù)職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110101；3.沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部 疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034；4.吉林大學(xué) 第一臨床醫(yī)院，吉林 長春 130021；5.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016

北蟲草小分子肽是由北蟲草子實(shí)體蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后生成，具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基的功能，相對分子質(zhì)量低于10 000 的小分子肽類。本課題組前期工作表明，北蟲草含有17 種氨基酸[1]，其中多種氨基酸如半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和纈氨酸、5-羥色氨酸及其衍生物具有抗氧化能力。氧化反應(yīng)在人體代謝過程中產(chǎn)生自由基和活性氧基團(tuán)，這些基團(tuán)過多會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生致死性損傷，特別是自由基可與活細(xì)胞中的糖、氨基酸、磷脂、核酸等發(fā)生反應(yīng)而造成機(jī)體中毒。為進(jìn)一步研究北蟲草小分子肽抗氧化活性機(jī)制，開發(fā)北蟲草小分子肽的實(shí)用價(jià)值，我們利用化學(xué)模型和動(dòng)物模型探討了北蟲草小分子肽的抗氧化和心肌耐缺氧機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，體重（200±25）g，購自沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部（動(dòng)物合格證號：遼實(shí)動(dòng)字號第033 號），在實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度（16±2）℃，顆粒飼料，自動(dòng)進(jìn)食飲水，適應(yīng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。北蟲草小分子肽（5.78 mg/mL）以人工培養(yǎng)北蟲草子實(shí)體為原料，經(jīng)粉碎、蛋白提取、加熱酶解、滅酶、抽濾、超濾和滅菌制備獲得，為相對分子質(zhì)量低于10 000 的混合物。木瓜蛋白酶購于廣州裕立寶生物科技公司；堿性蛋白酶購于Novozymes 公司；PTN6.0 購于杭州三葉生物化工廠；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、谷胱甘肽（GSH，色譜純）和Ferrozine鐵試劑（分析純）購自Sigma 公司；鄰二氮菲、二苯代苦味肼、鄰苯三酚、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等試劑均為分析純，購自國內(nèi)試劑公司。WFZ UV-2000 型紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯公司）；KND-2C型定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；PHS-25 數(shù)顯pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；101A-2 型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；GL-21M 高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 小分子肽清除羥基自由基（·OH-）能力測定[2]

采用鄰二氮菲法，以去離子水配制濃度分別1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的小分子肽溶液與還原型GSH對照液。

樣品管：取1.5 mL 鄰二氮菲溶液（5 mmol/L）加入2 mL磷酸鹽緩沖液（pH7.4）混勻，加入2 mL樣品溶液及0.5 mL EDTA（15 mmol/L），混勻，加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），用去離子水補(bǔ)至9 mL，充分混勻后加入1 mL H2O2（0.1%），搖勻，置37℃保溫1 h，以D536nm值變化反映羥基自由基的氧化作用。損傷管：以去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管。未損傷管：以去離子水代替H2O2，同損傷管。以還原型GSH為對照，計(jì)算·OH-清除率。

1.3 小分子肽清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH-·）測定[3]

取0.00 395 g DPPH，用95%乙醇溶解定容至100 mL，配置成0.1 mmol/L 的DPPH 溶液。小分子肽溶液與還原型GSH 對照液同1.2。取各樣品液和對照液2.0 mL 與2.0 mL DPPH 溶液混勻，置室溫30 min，測定D517nm值，以95%乙醇為空白對照，取3次測定的平均值，計(jì)算DPPH-·清除率。

1.4 小分子肽清除超氧陰離子自由基（）測定[4]

將鄰苯三酚溶于10 mmol/L HCl，配置成3 mmol/L 的溶液，小分子肽溶液與還原型GSH 對照液同1.2。取100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.2）4.5 mL，25℃水浴20 min 后立即加樣品2 mL、蒸餾水3 mL、鄰苯三酚0.5 mL（25℃保溫），迅速混勻，恒溫下每隔30 s測一次D325nm值，反應(yīng)4.5 min 結(jié)束，樣品抑制鄰苯三酚自氧化速率為V樣；空白管以10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液，反應(yīng)啟動(dòng)后4.5 min 內(nèi)鄰苯三酚自氧化速率為V自，按下式計(jì)算清除率：

1.5 小分子肽提高心肌耐缺氧能力測定

[5]并有改動(dòng)。大鼠48只隨機(jī)分為4組，即對照組、實(shí)驗(yàn)組（包括3、10、30 mg/kg 組）。實(shí)驗(yàn)組按1.0 mL/20 g體重每天灌胃，對照組給予同體積的蒸餾水，持續(xù)4周，末次給藥后1 h麻醉動(dòng)物，切開頸部皮膚，分離氣管，四肢連接心電監(jiān)護(hù)儀，觀察心肌活動(dòng)情況，然后用動(dòng)脈夾夾住氣管，并按動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，直至心臟停止跳動(dòng)，記錄心肌耐缺氧時(shí)間。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果以表示，組間的兩兩比較采用單因素方差分析，組間P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 小分子肽清除·OH-的能力

結(jié)果見圖1，小分子肽和GSH 濃度為1～3 mg/mL 時(shí)，二者清除·OH-的能力隨濃度增加而升高，小分子肽組明顯高于GSH 對照組［（87.6±1.72）%和（70.4±0.94）%，P＜0.05］；當(dāng)濃度為4～5 mg/mL 時(shí)，對·OH-的清除能力趨于平緩，兩者無顯著性差異［（89.7±1.63）%和（88.9±1.41）%，P＞0.05］。

圖1 小分子肽清除·OH-能力測定

2.2 小分子肽清除DPPH-·的能力

結(jié)果見圖2，隨小分子肽和GSH 濃度的增加，兩者清除DPPH-·的能力也提高，小分子肽組明顯高于GSH 對照組［（77.7±0.17）%和（55.7±0.29）%，P＜0.05］；當(dāng)濃度為3 mg/mL 時(shí)，兩者對DPPH-·的清除率達(dá)80%以上，但濃度繼續(xù)增加時(shí)其清除力趨于平臺期，對DPPH-·的清除能力基本接近［（90.1±0.14）%和（86.9±1.06）%，P＞0.05］。

2.4 心肌耐缺氧能力測定

結(jié)果見表1，北蟲草小分子肽對小鼠有抗心肌缺氧的作用，與對照組比較差異顯著（P＜0.01），呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量的增加，作用加強(qiáng)。

圖2 小分子肽清除DPPH-·能力測定

圖3 小分子肽清除·能力測定

表1 北蟲草小分子肽對小鼠心肌耐缺氧的影響（n=12，）

表1 北蟲草小分子肽對小鼠心肌耐缺氧的影響（n=12，）

*與對照組比較，P＜0.01

3 討論

1956年英國學(xué)者Harman就提出了自由基學(xué)說，認(rèn)為自由基具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性，是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，能夠攻擊生物大分子，造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。正常情況下，人體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡中，但自由基產(chǎn)生過多或清除過慢時(shí)，它通過攻擊生物大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，會(huì)造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北蟲草小分子肽對·OH-和DPPH-·的清除能力在一定的劑量范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)，達(dá)到一定劑量時(shí)出現(xiàn)平臺期，并與GSH的清除能力相同。在·的清除能力方面，小分子肽弱于GSH。在此基礎(chǔ)上的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，北蟲草小分子肽對大鼠具有耐心肌缺氧的作用，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。分析探討其機(jī)理，氨基酸種類、序列和構(gòu)型可能是決定其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。我們用高效液相色譜測定，北蟲草含有豐富的亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸等[8]，其中谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量接近亮氨酸、酪氨酸的2 倍。這些氨基酸殘基是組成抗氧化肽的必要成分，它們通過將氫原子提供給自由基，形成吲哚自由基和苯氧自由基，借助共振而穩(wěn)定，達(dá)到自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止的目的[9]。芳香族氨基酸可通過供氫發(fā)揮抗氧化作用。如酪氨酸是典型的供氫體，苯環(huán)為共軛體系，使其酚羥基上電子氧電子云密度增大，其共軛體系受側(cè)鏈上的基團(tuán)影響，尤其是酪氨酸對位的甲基，其誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)一步使酚羥基氧的密度增大，并且使其脫掉質(zhì)子后形成的自由基中間體更趨于穩(wěn)定，所以認(rèn)為抗氧化肽的高生物活性在于肽鏈內(nèi)氨基酸間的短程相互作用，強(qiáng)化了酪氨酸等作為質(zhì)子供體的作用，增加了作為自由基中間體的穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道，有抗氧化作用的肽具有通過清除自由基，增加Ca2+-Mg2+-ATP 酶（Ca2+泵）和Ca+-K+-ATP 酶（Na+泵）活性的作用，間接實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞耐缺氧，延緩心肌衰老[10]。

綜上，北蟲草小分子肽是食品、保健品和化妝品領(lǐng)域具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的生物活性肽。

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