王盛鋒, 劉云霞, 高麗麗, 韓 亞, 黃金生,Hilman, 劉榮樂, 汪 洪*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所， 農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點開放實驗室， 北京 100081;2 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院， 北京 100081)

鋅是植物必需的微量元素，對植物體內(nèi)碳水化合物、 蛋白質、 生長素等物質代謝以及生長發(fā)育具有重要作用[1-2]。世界上缺鋅土壤面積約占30%[3]，甚至可能高達50%[4]。據(jù)1997年公布的全國土壤普查數(shù)據(jù)，我國缺鋅土壤面積約有0.63億公頃，占當時耕地總面積45.7%。Yang等[5]和Zou等[6]估計我國缺鋅土壤面積約在40%以上。北方石灰性土壤上，作物缺鋅尤為普遍[7]。玉米對缺鋅敏感，缺鋅時常表現(xiàn)為莖節(jié)間縮短、 新葉失綠黃化，嚴重時出現(xiàn)壞死性斑點[1-2]。

傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)是一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結構分析技術，F(xiàn)TIR技術可對樣品進行定性和定量分析，具有靈敏度高，制樣方法簡單，樣品用量少，測試時間短等優(yōu)點[8]。植物體內(nèi)生物大分子如核酸，脂類和碳水化合物，具有特征性的官能團和獨特的分子振動模式(振動的指紋)[9]。通過分析紅外光譜吸收位置、 寬度和強度，有助于了解植物體內(nèi)有機物分子官能團的組成和結構特征[10-11]。歐全宏等[12]利用FTIR研究水稻稻瘟病葉、 玉米和蠶豆銹病葉，發(fā)現(xiàn)主要由多糖、 蛋白質的振動吸收譜帶組成，葉片中主要成分糖類、 蛋白質和脂類化合物在正常葉片和感病葉片之間存在明顯差異。Shi[13]研究發(fā)現(xiàn)玉米銹病發(fā)病葉和正常葉片的FTIR圖譜在酰胺I和II吸收帶上差異明顯，認為病程相關蛋白在抵抗病原體侵染中起著重要作用。薛生國等[14]進行了紫茉莉對鉛脅迫生理響應的FTIR 研究，結果表明， 根組織在3420、 2920、 1610和1060 cm-1等處峰高隨鉛處理濃度表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，說明低鉛處理下植株體內(nèi)蛋白質、 氨基酸、 糖類、 羧酸等含量較高，但隨鉛處理濃度增加，植株體內(nèi)有機物含量逐漸下降； 葉組織在1650 cm-1處峰高隨鉛處理濃度升高而升高，這可能與紫茉莉葉中蛋白質和氨基酸等物質含量升高有關。

利用FTIR研究缺鋅脅迫下植物體內(nèi)化學組分的變化，尚未見到有關文獻。本試驗選擇農(nóng)大108和鄭單958兩個玉米品種為供試作物，進行營養(yǎng)液培養(yǎng)，研究缺鋅脅迫下玉米幼苗生長和鋅吸收，利用FTIR對玉米植株不同器官的化學組成進行研究，以期為缺鋅影響玉米生長與生理代謝的機理研究提供參考。

1 材料與方法

選取農(nóng)大108和鄭單958兩個玉米品種，飽滿一致的玉米種子經(jīng)10% H2O2表面消毒15 min，去離子水洗凈，浸泡12 h后，轉移到鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1天。選擇發(fā)芽一致的種子播于洗凈的石英砂中，室溫下育苗。7天后(兩葉一心)，選擇長勢一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培養(yǎng)管中進行營養(yǎng)液培養(yǎng)，每管1株。玻璃培養(yǎng)管直徑為5 cm，高20 cm，外用黑色塑料布包裹遮光。

基礎營養(yǎng)液配方為(mol/L): Ca(NO3)22.0×10-3、 K2SO47.5×10-4、 MgSO46.5×10-4、 KH2PO42.5×10-4、 EDTA-Fe(Ⅱ)1.0×10-4、 H3BO31.0×10-6、 MnSO41.0×10-6、 CuSO41.0×10-7、 (NH4)6Mo7O245.0×10-9。設置缺鋅(0 μmol/L)和正常供鋅(1 μmol/L)兩個處理，代號分別為-Zn 和+Zn。鋅以ZnSO4形式供給，每個處理4次重復。營養(yǎng)液pH用NaOH或HCl調到6.2，每隔兩天換一次營養(yǎng)液。幼苗培養(yǎng)在人工氣候箱進行，控制條件光照時間 12 h，光照強度24000 lx，晝夜溫度為25℃/20℃，相對濕度70%。

營養(yǎng)液處理20天后，玉米缺鋅癥狀明顯表現(xiàn)為生長矮小、 節(jié)間縮短、 葉片黃化。將地上部和根系分開，用直尺測量長度，獲得株高和根長； 植株樣品經(jīng)105℃殺青1 h，再在80℃下烘干至恒重，測干重。烘干至恒重的植株樣品用HNO3-HClO4(3 ∶1)消煮，原子吸收分光光度計(型號WFX-120C，北京瑞利分析儀器公司)測定消煮液中鋅濃度，計算植株中鋅含量和鋅積累量。收獲玉米根系放入FAA固定液(70%酒精 ∶38%甲醛 ∶乙酸體積比=90 ∶5 ∶5)中，利用掃描儀(EsponV 700)掃描根系樣品獲取數(shù)字化圖像，利用用WinRHIZO根系分析軟件(Regent Instruments Inc., Canada)對圖像進行分析，獲得根長、 根面積、 根體積等指標。

對數(shù)據(jù)進行方差統(tǒng)計分析(ANOVA)，采用Duncan新復極差方法檢驗不同處理之間數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 生物量和鋅含量

缺鋅嚴重影響玉米的生長，植株生長矮小，節(jié)間縮短，株高下降，新葉基部出現(xiàn)黃化后白化，并出現(xiàn)壞死性褐色斑點。

表1結果表明，施鋅增加地上部干重，而缺鋅導致地上部干物質重降低，鋅營養(yǎng)對地上部影響顯著，而對根系生物量影響不明顯。缺鋅時根冠比增大，兩個品種比較，缺鋅條件下農(nóng)大108具有更大根冠比。不施鋅玉米植株地上部和根系中鋅含量明顯降低。根系鋅含量高于地上部鋅含量。

缺鋅與施鋅地上部生物量比值: 農(nóng)大108為0.45，小于鄭單958(0.64)，缺鋅脅迫下農(nóng)大108生物量下降較鄭單958多。

表1 缺鋅和施鋅處理下玉米生物量和鋅含量

2.2 根系形態(tài)

與供鋅處理相比，缺鋅明顯降低了農(nóng)大108根系長、 根面積、 根體積； 鄭單958根系各項指標在缺鋅和供鋅處理之間差異不顯著(表2)。

表2 缺鋅和施鋅處理下玉米根系形態(tài)

2.3 FTIR譜圖分析

2.3.1 根 FTIR譜分析 圖1可以看出，缺鋅和施鋅處理根系紅外光譜的特征峰位置基本相同，但透過率有差異。缺鋅根系紅外光譜在3410、 2920、 1650、 1380、 1055 cm-1附近透過率較低。

3410 cm-1是自由羥基的伸縮振動峰，主要來自于多糖、 纖維素、 半纖維素等碳水化合物[15]； 1055 cm-1是C-O-C伸縮振動，來源于多糖類[16-18]，缺鋅條件下兩處透過率的升高表明根系碳水化合物的減少。

兩品種比較， 農(nóng)大108根系在缺鋅和加鋅處理間1540、 1380、 1240 cm-1附近透過率的差異大于鄭單958根系，表明農(nóng)大108根系中蛋白質、 核酸受缺鋅影響更大。

圖1 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958根FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of roots of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

2.3.2 莖FTIR譜分析 圖2表明缺鋅和供鋅處理莖的紅外光譜特征峰對應的波數(shù)基本相同，缺鋅農(nóng)大108莖的紅外光譜在3410、 2920、 1655、 1380、 1240和1055 cm-1附近透過率降低，表明碳水化合物、 脂類、 蛋白質和核酸含量升高。缺鋅下鄭單958莖的紅外光譜在3410、 2920、 1655、 1380 cm-1附近透過率降低，表明碳水化合物、 脂類、 蛋白質含量升高。兩品種比較，農(nóng)大108在3420、 1655、 1380、 1240、 1055 cm-1附近透過率差異較大，鄭單958在1240和1055 cm-1透過率基本相同。

缺鋅農(nóng)大108莖中碳水化合物、 脂類、 蛋白質含量增加較多，鄭單958莖中核酸和多糖含量受到影響較小。

圖2 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958莖FTIR譜圖Fig.2 FTIR spectra of stems of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

2.3.3 葉片F(xiàn)TIR譜分析 從圖3可以看出， 與正常供鋅處理相比，兩個品種缺鋅條件下葉片F(xiàn)TIR譜在3420與2920 cm-1處透過率升高，糖類、 纖維素類碳水化合物、 脂類等物質含量下降。

農(nóng)大108葉片F(xiàn)TIR譜中1655、 1380、 1240和1050 cm-1處透過率升高，蛋白質、 核酸和多糖含量下降。鄭單958缺鋅葉片紅外圖譜中1380 cm-1透過率下降，主要是蛋白質中甲基和亞甲基C-H彎曲振動和羧基中C-O彎曲振動減少，蛋白含量受到一定影響，而1650、 1240、 1055 cm-1附近與加鋅處理相比無明顯變化，酰胺I帶蛋白含量和多糖含量受鋅影響較小。

圖3 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958葉片F(xiàn)TIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of leaves of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

3 討論與結論

將缺鋅和正常供鋅水平下生物產(chǎn)量的比值定義為玉米鋅效率系數(shù)，若該系數(shù)較低，作物對缺鋅相對敏感[24-25]。本試驗中供試的兩玉米品種比較，缺鋅條件下，農(nóng)大108地上部干物質積累較少，缺鋅和施鋅處理下地上部生物量比值明顯較鄭單958小，根冠比較大，農(nóng)大108比鄭單958可能對缺鋅更為敏感。

根系形態(tài)的差異可能會影響植物對鋅吸收利用[26]，Dong 等[27]研究發(fā)現(xiàn)缺鋅條件下小麥鋅高效品種細根長度增加，所占比例增多。水稻上的研究也發(fā)現(xiàn)在中度缺鋅時根系長度、 根面積和根尖數(shù)增加，且鋅高效品種增加更多[28]。本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅培養(yǎng)20天的玉米品種農(nóng)大108根系生長受抑，根長、 根面積和根體積下降，而鄭單958根系形態(tài)變化尚不明顯。缺鋅時鄭單958具有較大根表面積和根體積，細根較多，可能是其對缺鋅不敏感的一個重要原因。

FTIR方法測定分子吸收光譜，由分子振動或轉動引起偶極矩的凈變化產(chǎn)生，從而可以鑒定化合物和分子結構，紅外光譜具有“指紋”特征，可對植物所含化學物質提供鑒別[8]。薛生國等[14]和歐全宏等[12]研究發(fā)現(xiàn)植物FTIR譜圖的特征峰集中在3420、 2920、 1610和1060 cm-1附近，認為主要由多糖、 脂類、 蛋白質的振動吸收譜帶組成。本試驗發(fā)現(xiàn)玉米根、 莖、 葉FTIR譜圖特征峰集中在3410、 2920、 1650、 1380、 1055和 1240 cm-1附近，推斷主要由碳水化合物、 脂類和蛋白質中基團的振動組成，透射率的高低可近似代表特征物質含量。

本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅處理根系和葉片F(xiàn)TIR圖譜中3410和1055 cm-1透過率較高，莖FTIR圖譜中此波數(shù)附近透過率較低，表明缺鋅時碳水化合物在玉米葉片和根系中含量下降，而在莖中可能有所積累。鋅是碳酸酐酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的組成成分[29-30]，缺鋅時光合作用下降，碳水化合物代謝受到影響。缺鋅菜豆植株中淀粉、 淀粉合成酶活性以及淀粉粒數(shù)下降[31]，甜菜和玉米中蔗糖合成酶活性降低，蔗糖含量下降[32]。也有報道表明缺鋅時菜豆葉片中蔗糖和淀粉含量升高，但根系中碳水化合物的濃度降低，對此的解釋是缺鋅可能抑制源葉向外運輸[33]。植物莖中碳水化合物含量升高可能是由于生長受阻引起的濃度效應。

本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅處理根系和葉片F(xiàn)TIR圖譜中1650和1380 cm-1透過率及1240 cm-1處透過率較高，表明缺鋅時蛋白質及核酸在玉米葉片和根系中含量下降。李佐同等[34]報道低鋅處理降低玉米葉片可溶性蛋白質含量。缺鋅植物體內(nèi)RNase活性升高，導致RNA降解，含量降低，缺鋅時核糖體變形、 減少[1,29]。另外鋅是RNA聚合酶的必要組分[35]，該酶保護核糖RNA免受核糖核酸酶的攻擊而降解，缺鋅時該酶活性明顯下降。另外轉錄因子鋅指蛋白中含有鋅，鋅指蛋白與特定的靶DNA或靶蛋白結合負責調控基因的表達，影響蛋白質合成，缺鋅可能降低鋅指蛋白含量。

綜上所述，缺鋅條件下玉米根系和葉片F(xiàn)TIR譜在波數(shù)3410、 2920、 1650、 1380、 1055 cm-1附近處透過率較高，莖FTIR譜在這些波數(shù)處透過率較低，表明缺鋅導致根系和葉片中碳水化合物、 脂類、 蛋白質及核酸含量下降，而在莖中有所積累。玉米品種農(nóng)大108植株中各組分變化受缺鋅影響較鄭單958大。本文結果表明， 利用FTIR技術可揭示缺鋅脅迫玉米植株中組分變化。

參考文獻:

[1] Marschner H. Mineral nutrition of higher plants (2ndEd.)[M]. Academic Press, 1995.

[2] Alloway B J. Zinc in soils and crop nutrition (2ndEd)[M]. Brussels, Belgium and Paris, France: International Zinc Association and International Fertilizer Industry Association, 2008.

[3] Takkar P N, Walker C D. The distribution and correction of zinc deficiency[A]. Robson A D. Zinc in Soils and Plants [M]. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1993. 151-165.

[4] Alloway B J. Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans[J]. Environmental Geochemistry and Health, 2009, 31(5): 537-548.

[5] Yang X E, Chen W R, Feng Y. Improving human micronutrient nutrition through biofortification in the soil-plant system: China as a case study[J]. Environmental Geochemistry and Health, 2007, 29(5): 413-428.

[6] Zou C, Gao X, Shi Retal. Micronutrient deficiencies in crop production in China[A]. Alloway B J. Micronutrient deficiencies in global crop production[M]. New York: Springer-Verlag Inc. Netherlands, 2008. 127-148.

[7] 劉錚. 中國土壤微量元素[M]. 南京: 江蘇科學技術出版社, 1996.

Liu Z. Trace element in soil of China[M]. Nanjing: Jiangsu Science and Technology Press, 1996.

[8] 翁詩甫. 傅立葉變換紅外光譜分析[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2010.

Weng S F. Fourier transform infrared spectrum analysis[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2010.

[9] Griffiths P, De Haseth J A. Fourier transform infrared spectrometry(2nd ed)[M]. NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, 2006.

[10] Mantsch H, Chapman D. Infrared spectroscopy of biomolecules[M]. New York: Wiley-Liss, 1996.

[11] Yee N, Benning L G, Phoenix V Retal. Characterization of metal-cyanobacteria sorption reactions: a combined macroscopic and infrared spectroscopic investigation[J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(3): 775-782.

[12] 歐全宏, 趙興祥, 周湘萍, 等. 稻瘟病、 玉米銹病和蠶豆銹病葉的傅里葉變換紅外光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2012, (9): 2389-2392.

Ou Q H, Zhao X X, Zhou X Petal. Research on rice blast, corn and broad bean rust leaves by FTIR spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2012, 9: 2389-2392.

[13] Shi Y. Identification of maize southern rust using FTIR spectroscopy[A]. IEEE. Symposium on photonics and optoelectronics (SOPO2012)[C]. Shanghai, 2012. 1-3.

[14] 薛生國，朱鋒，葉晟，等. 紫茉莉對鉛脅迫生理響應的FTIR研究[J]. 生態(tài)學報, 2011, 31(20): 6143-6148.

Xue S G, Zhu F, Ye Setal. Physiological response ofMirabilisjalapaLinn. to lead stress by FTIR spectroscopy[J]. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(20): 6143-6148.

[15] Dziubaa B, Babuchowskia A, Dorota Netal. Identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and cluster analysis[J]. International Dairy Journal, 2007. 17(3): 183-189.

[16] 陸婉珍. 現(xiàn)代近紅外光譜分析技術[M]. 北京: 中國石化出版社， 2007.

Lu W Z. Near infrared spectral analysis technology[M]. Beijing: China Petrochemical Press, 2007.

[17] Wong P T, Wong R K, Caputo T Aetal. Infrared spectroscopy of exfoliated human cervical cells: evidence of extensive structural changes during carcinogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88(24): 10988-10992.

[18] Zeroual W, Choisy C, Doglia S Metal. Monitoring of bacterial growth and structural analysis as probed by FTIR spectroscopy[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1994, 1222(2): 171-178.

[19] Jackson M, Mantsch H H. Biomembrane structure from FTIR spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Reviews, 1993, 15: 53-69.

[20] Williams D H, Fleming I. Spectroscopic methods in organic chemistry (5thEd)[M]. London: McGraw-Hill, 1996.

[21] Salzmann D, Handley R J, Müller-Sch?rer H. Functional significance of triazine-herbicide resistance in defense ofSeneciovulgarisagainst a rust fungus[J]. Basic and Applied Ecology, 2008, 9(5): 577-587.

[22] 孫素琴， 周群， 陳建波. 中藥紅外光譜分析與鑒定[M]. 化學工業(yè)出版社, 2010.

Sun S Q, Zhou Q, Chen J B. Infrared spectrum analysis and appraisal of Chinese medicine[M]. Chemical Industry Press, 2010.

[23] Nelson W H. Modern Techniques for rapid microbiological analysis[M]. Weinheim, Germany: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 1991.

[24] 王景安, 張福鎖. 不同鋅水平對玉米生長發(fā)育和鋅吸收的影響[J]. 玉米科學, 1999, 7(3): 73-76.

Wang J A, Zhang F S. The effects of different zinc levels on maize growth and development and zinc uptake[J]. Journal of Maize Science, 1999, 7(3): 73-76.

[25] 趙同科，曹云者，馬麗敏，等. 不同玉米基因型缺鋅脅迫適應性研究[J]. 華北農(nóng)學報, 2000, 15(增刊): 64-68.

Zhao T K, Cao Y Z, Ma L Metal. Research on adaptability of different corn genotypes under zinc stress[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2000, 15(Suppl.): 64-68.

[26] Rengel Z, Graham R D. Wheat genotypes differ in Zn efficiency when grown in chelate-buffered nutrient solution[J]. Plant and Soil, 1995, 176(2): 307-316.

[27] Dong B, Rengel Z, Graham R D. Root morphology of wheat genotypes differing in zinc efficiency[J]. Journal of Plant Nutrition, 1995, 18(12): 2761-2773.

[28] Chen W R, He Z L, Yang X Eetal. Zinc efficiency is correlated with root morphology, ultrastructure, and antioxidative enzymes in rice[J]. Journal of Plant Nutrition, 2009, 32: 287-305.

[29] Brown P H, Cakmak I and Zhang Q. Form and function of zinc in plants [A]. Robson A D. Zinc in Soils and Plants[M]. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1993. 93-106.

[30] Burnell J N. Carbonic anhydrases of higher plants: an overview[A]. Chegwidden W R, Carter N D, Edwards Y H. EXS [M]. Basel, Switzerland: Birkhaeuser Boston, 2000, 90:501-518.

[31] Jyung W H, Ehmann A, Schlender K Ketal. Zinc nutrition and starch metabolism inPhaseolusvulgaris. L[J]. Plant Physiology, 1975, 55(2): 414-420.

[32] Shrotri C K, Tewari M N, Rathore V S. Effect of zinc nutrition on sucrose biosynthesis in maize[J]. Phytochemistry, 1980, 19(1): 139-140.

[33] Marschenr H, Cakmak I. High light intensity enhances chlorosis and nrcrosis in leaves of zinc, phosphorous and magnesium deficient bean (Phaseolusvulgaris) plant[J]. Journal of Plant Physiology, 1989, 134: 308-315.

[34] 李佐同， 楊克軍， 王玉鳳, 等. 鋅對不同基因型玉米幼苗碳氮代謝的影響[J]. 植物生理學通訊, 2010, 7: 664-670.

Li Z T, Yang K J, Wang Y Fetal. The influence of zinc on carbon and nitrogen metabolism of different genotype maize seedling[J]. Plant Physiology Communications, 2010, 7: 664-670.

[35] Falchuk K H, Hardy C, Ulpino Letal. RNA metabolism, manganese, and RNA polymerases of zinc-sufficient and zinc-deficientEuglenagracilis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1978, 75(9): 4175-4179.

[36] 汪洪， 金繼運. 鐵、 鎂、 鋅營養(yǎng)脅迫對植物體內(nèi)活性氧代謝影響機制[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2006, 12(5): 738-744.

Wang H, Jin J Y. Possible effects of iron, magnesium and zinc on the metabolism of reactive oxygen species in plants[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2006, 12(5): 738-744.

[37] Cakmak I. Possible roles of zinc in protecting plant cells from damage by reactive oxygen species[J]. New Phytologist, 2000: 185-205.