王 森，李健爽，杜曉燕

代謝組學(xué)在轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

王 森，李健爽，杜曉燕*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081）

外源基因的非預(yù)期效應(yīng)可能形成新的代謝產(chǎn)物或改變代謝模式，也可能引起轉(zhuǎn)基因作物的營養(yǎng)成分發(fā)生改變，甚至可能會(huì)產(chǎn)生一些新的有毒物質(zhì)，是轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一。本文主要對(duì)近年來代謝組學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)中的最新應(yīng)用做了總結(jié)，并闡述了對(duì)該研究領(lǐng)域的預(yù)期，以期促進(jìn)轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)體系的發(fā)展和完善。

轉(zhuǎn)基因作物；代謝組學(xué)；非預(yù)期效應(yīng)；評(píng)價(jià)

近年來，由于轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化和大面積種植，有關(guān)其非預(yù)期效應(yīng)和生態(tài)安全的研究成為熱點(diǎn)問題。在已頒布的管理法規(guī)、安全性評(píng)價(jià)原則及技術(shù)方案中，非預(yù)期效應(yīng)的篩查和評(píng)價(jià)都被列為重要內(nèi)容。非預(yù)期效應(yīng)是指外源基因的轉(zhuǎn)入導(dǎo)致農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的表型性狀和遺傳性狀在傳代、生長、發(fā)育和代謝等過程中發(fā)生偏離基因工程設(shè)計(jì)目標(biāo)的變異或抗生素抗性基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[1]。由于外源基因的非預(yù)期效應(yīng)具有潛在性、非預(yù)見性，因此以實(shí)質(zhì)等同性為基礎(chǔ)的定向方法很難充分考慮到由基因修飾所引起的非預(yù)期效應(yīng)?！皩?shí)質(zhì)等同性”這一概念是由世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）最早提出，其本質(zhì)是比較原則，即將轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品從表形性狀、農(nóng)學(xué)性狀、組成成分等方面進(jìn)行比較，從而得出轉(zhuǎn)基因食品是否與傳統(tǒng)食品具有實(shí)質(zhì)等同性的結(jié)論，它是目前普遍公認(rèn)的評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因食品安全性的有效途徑。組學(xué)技術(shù)是近年發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，它的應(yīng)用大大增加了篩查非預(yù)期效應(yīng)的機(jī)會(huì)[2]。利用代謝組學(xué)技術(shù)從代謝水平上比較轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物的代謝差異，是篩查轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的一個(gè)頗具前途的重要技術(shù)手段。

1 轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的來源

1.1 目標(biāo)性狀變異

目標(biāo)性狀包括與外源基因功能相關(guān)的表形性狀和遺傳性狀。轉(zhuǎn)基因作物任何目標(biāo)性狀變異直接或間接的與轉(zhuǎn)錄的變化、外源基因的表達(dá)及其調(diào)控功能有關(guān)。目標(biāo)遺傳性狀變異是目標(biāo)表型性狀變異的一個(gè)內(nèi)在因素。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化效應(yīng)、位置效應(yīng)、重組效應(yīng)和修飾效應(yīng)都能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物的目標(biāo)遺傳性狀發(fā)生變異[3]。

1.2 非目標(biāo)性狀變異

非目標(biāo)性狀包括轉(zhuǎn)基因生物的表型性狀和遺傳性狀，轉(zhuǎn)入基因的功能忽略不計(jì)，但是轉(zhuǎn)入基因?qū)κ荏w內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控功能的影響都可導(dǎo)致非目標(biāo)性狀發(fā)生變異。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，非目標(biāo)遺傳性狀變異與插入效應(yīng)、誘導(dǎo)效應(yīng)和異源效應(yīng)有關(guān)[3]。這些效應(yīng)可能導(dǎo)致非目標(biāo)遺傳性狀變異，并且進(jìn)一步引起表型性狀變異。

1.3 基因水平轉(zhuǎn)移

細(xì)胞間DNA水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制非常復(fù)雜，它受很多因素的限制。其中一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制是DNA在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化，DNA可以在同一物種以及不同物種的細(xì)胞間水平轉(zhuǎn)移。另一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制是外源基因的整合，DNA可以通過DNA重組插入到受體基因組中，包括同源重組、換位、位點(diǎn)特異性重組和DNA修復(fù)。基于這兩個(gè)機(jī)制，在轉(zhuǎn)基因作物中DNA可以水平轉(zhuǎn)移到其他生物細(xì)胞內(nèi)[3-4]。

2 轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的篩查方法

目前，轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的篩查方法主要包括定向方法和非定向方法。

2.1 定向方法

針對(duì)特定目標(biāo)的檢測(cè)方法稱為定向方法。該方法主要是對(duì)一些重要營養(yǎng)素和關(guān)鍵毒物進(jìn)行單成分分析，通過比較分析來確定轉(zhuǎn)基因品種和親本品種之間的是否存在差異，該方法已成功應(yīng)用于第一代轉(zhuǎn)基因作物的安全評(píng)價(jià)，并被國際組織廣泛接受。然而，定向方法已被普遍認(rèn)為存在以下兩方面的局限性[5]：一是至今仍沒有普遍公認(rèn)的、統(tǒng)一的指導(dǎo)方針來確定分析的完整程度；二是定向方法僅關(guān)注已知化合物和可預(yù)見的變化，結(jié)果可能存在偏倚。

2.2 非定向方法

由于定向方法的局限性，研究者們開始關(guān)注非定向方法。以組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的非定向方法已經(jīng)逐步形成而且備受關(guān)注。組學(xué)技術(shù)包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)[6]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)主要是研究轉(zhuǎn)基因作物的基因表達(dá)變化，檢測(cè)基因表達(dá)譜的差異性，作為基因修飾的非預(yù)期副作用的一個(gè)指證，以便為進(jìn)一步研究毒理學(xué)的相關(guān)性提供信息[5]。但是轉(zhuǎn)錄組的變化并不一定會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)組和代謝組也發(fā)生變化，因此不一定能預(yù)測(cè)到食品成分和質(zhì)量的變化[7]，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)中受到限制。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以為理解基因修飾后生物過程的變化提供重要的信息[8]。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組學(xué)非常適合檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物在基因組、基因調(diào)控、或生化途徑中的變化[9]。但是蛋白質(zhì)組學(xué)分析不夠快速，定量不典型，比較昂貴，并且需要專門的設(shè)備和軟件[7]。因此，降低了其在安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。與其他組學(xué)相比代謝組學(xué)更能反應(yīng)生物體的整體信息，并且基因表達(dá)和蛋白質(zhì)變化對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響都能在代謝水平上得到體現(xiàn)[10]。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因作物代謝譜或生物標(biāo)志物的研究，可以從代謝水平了解轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生的異常生理狀態(tài)，提高篩查效率。代謝組學(xué)技術(shù)有潛力成為篩查非預(yù)期效應(yīng)最有力的技術(shù)手段。

此外，轉(zhuǎn)基因生物的目標(biāo)性狀變異還存在另一種特殊形式，即轉(zhuǎn)基因生物基因組中整合的表達(dá)抗生素抗性產(chǎn)物的外源基因發(fā)生向其他非靶生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致非靶生物細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性。這種變異形式稱為抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移[11]。對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移的篩查方法一般是基于體內(nèi)和體外檢測(cè)模型[12]。轉(zhuǎn)基因作物的抗生素抗性基因可以向環(huán)境中或是動(dòng)物胃腸道內(nèi)的細(xì)菌轉(zhuǎn)移，根據(jù)模型，可以通過這兩個(gè)途徑檢測(cè)抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。

3 代謝組學(xué)在轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

常用的代謝組學(xué)分析技術(shù)主要有核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

3.1 核磁共振技術(shù)

NMR技術(shù)是最早應(yīng)用于代謝組學(xué)研究的手段之一，其優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)悠穼?shí)現(xiàn)無創(chuàng)性、無偏向的檢測(cè)，且無需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，易于鑒定化合物的結(jié)構(gòu)信息。它的缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度較低并且動(dòng)態(tài)范圍有限，難以同時(shí)對(duì)同一樣品中濃度相差很大的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[13]。

Piccioni等[14]采用一維和二維NMR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)Cry1A（b）基因玉米種子及其對(duì)應(yīng)的傳統(tǒng)玉米種子的代謝譜進(jìn)行了分析。轉(zhuǎn)基因樣品與非轉(zhuǎn)基因樣品相比，除了乙醇、檸檬酸、甜菜堿、海藻糖，以及尚未完全確定的另一種化合物濃度升高外，轉(zhuǎn)基因品種中沒有出現(xiàn)新物質(zhì)。Picone等[15]也采用NMR技術(shù)評(píng)估了轉(zhuǎn)基因葡萄，發(fā)現(xiàn)基因修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因葡萄與其對(duì)應(yīng)的野生品種在代謝水平上發(fā)生了不同程度的變化。此外，Kim等[16]采用傅里葉變換紅外光譜（fourier transformed infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）和1H-NMR光譜結(jié)合多變量分析對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖和野生型馬鈴薯塊莖做了比較分析，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和野生型馬鈴薯之間沒有出現(xiàn)代謝差異，但是新鮮馬鈴薯和貯藏1周之后的馬鈴薯差異比較明顯。

在以往的研究中，都是以體外評(píng)價(jià)模型為基礎(chǔ)，采用代謝組學(xué)方法分析轉(zhuǎn)基因作物的代謝物是否發(fā)生了非預(yù)期的代謝差異，Cao Sishuo等[17]通過代謝組學(xué)技術(shù)建立了一個(gè)新的體內(nèi)評(píng)價(jià)模型來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性。在這項(xiàng)研究中，分別飼喂大鼠轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻90 d，收集0、30、60、90 d 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的24 h尿液，用1H-NMR檢測(cè)大鼠尿液代謝物的變化，以考察與非轉(zhuǎn)基因水稻相比較轉(zhuǎn)基因水稻是否誘導(dǎo)了大鼠尿液的代謝物發(fā)生變化，并采用多變量分析和方差分析分別來確定差異和差異的顯著性。多變量分析結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組之間，與零時(shí)間點(diǎn)比較，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠尿液中的α-酮戊二酸和馬尿酸有不同的變化趨勢(shì)，而且在所有3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中轉(zhuǎn)基因組大鼠尿液的乙酸量都高于非轉(zhuǎn)基因組。然而，方差分析的結(jié)果表明，在第1個(gè)月轉(zhuǎn)基因組大鼠尿液中的α-酮戊二酸，馬尿酸和乙酸與非轉(zhuǎn)基因組有顯著差異，但是在第2個(gè)月和第3個(gè)月，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組比較大鼠尿液中的這些代謝物沒有差異。鑒于這些變化的不穩(wěn)定性和不連續(xù)性，不能認(rèn)為這些變化與轉(zhuǎn)基因水稻有關(guān)。最終得出結(jié)論，這些差異并不具有生物學(xué)意義。這是首次采用NMR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品90 d喂養(yǎng)大鼠尿液進(jìn)行代謝物分析，該方法是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物安全評(píng)價(jià)方法的補(bǔ)充。作為一種非侵入性、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方法，代謝組學(xué)將會(huì)為轉(zhuǎn)基因作物及其食品的安全性評(píng)價(jià)開辟新的道路。

3.2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

利用色譜的分離作用和質(zhì)譜的鑒定作用能夠?qū)Υx物進(jìn)行準(zhǔn)確定量和快速定性分析，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)研究中顯示出了巨大的發(fā)展?jié)摿?，常用的色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)主要有以下幾種。

3.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）

由于GC-MS具有較高的分離效率和靈敏度，易于操作且較為經(jīng)濟(jì)，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)分析。但是GC-MS僅限于分析揮發(fā)性的物質(zhì)，無法分析熱不穩(wěn)定性和分子質(zhì)量較大的代謝產(chǎn)物[13,18]。

為了研究轉(zhuǎn)兩種抗蟲基因（cryIAc和sck）水稻在代謝水平上是否導(dǎo)致了非預(yù)期效應(yīng)，Zhou Jia等[19]采用氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）和GC-MS相結(jié)合的方法尋找轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻之間的代謝變化。為了確定環(huán)境因素對(duì)代謝物的影響，還檢測(cè)了不同播種日期或地點(diǎn)的野生型樣品。對(duì)谷物中的極性化合物進(jìn)行提取和三甲基硅烷化后，再用GC-FID進(jìn)行分析。利用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）來區(qū)分轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻，挑選出有顯著性差異的代謝物，然后通過GC-MS進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素對(duì)水稻某些代謝物誘導(dǎo)了相似的影響，如轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品中3-磷酸甘油、檸檬酸、油酸、蔗糖等的含量都有較大幅度增加。而與非轉(zhuǎn)基因水稻比較，轉(zhuǎn)基因水稻中的蔗糖、甘露醇和谷氨酸含量增加較顯著，提示這幾種代謝物的差異可能與基因修飾相關(guān)。他們的研究區(qū)分了環(huán)境因素與基因修飾所導(dǎo)致的代謝物差異，對(duì)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期效應(yīng)有著重要意義。當(dāng)然，要獲得更多關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻安全評(píng)價(jià)的信息，還有很多工作有待完成。另外，F(xiàn)rank等[20]采用GC-MS調(diào)查了轉(zhuǎn)Bt基因玉米及其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因品種的代謝差異，發(fā)現(xiàn)觀察到的大部分差異都與環(huán)境因素導(dǎo)致的自然變異有關(guān)，與基因修飾關(guān)系不大。由于非預(yù)期效應(yīng)不但會(huì)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物中，也會(huì)出現(xiàn)在傳統(tǒng)農(nóng)作物的育種和生長過程中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品非預(yù)期效應(yīng)的篩查更加困難。代謝組學(xué)技術(shù)在鑒別基因修飾和環(huán)境因素導(dǎo)致的非預(yù)期效應(yīng)方面表現(xiàn)出了極大的潛力。

Kim等[21-22]應(yīng)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）對(duì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物的營養(yǎng)價(jià)值所導(dǎo)致的非預(yù)期變化進(jìn)行了評(píng)估。該方法準(zhǔn)確、靈敏，而且非?？焖佟Ｋ麄儾捎肎C-TOF-MS檢測(cè)了β-胡蘿卜素生物強(qiáng)化水稻的14種親脂性化合物[21]；又采用同樣的方法分析了類胡蘿素生物強(qiáng)化水稻和5種傳統(tǒng)水稻品種的52種極性代謝物，均未出現(xiàn)非預(yù)期的不良變化[22]。

3.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）

LC-MS也是一種在轉(zhuǎn)基因作物代謝組學(xué)研究中常用的手段。LC-MS不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，并且具有較高的靈敏度和較寬的動(dòng)態(tài)范圍，可重復(fù)定量分析，適用于分離和分析那些極端復(fù)雜的樣品[13,23]。目前，LC-MS技術(shù)已發(fā)展成為代謝組學(xué)研究的主流技術(shù)手段。

Chang Yuwei等[24]采用快速高分離液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（rapid resolution liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry，RRLC-TOF-MS）分析了水稻種子。研究發(fā)現(xiàn)該方法的線性、重現(xiàn)性、日內(nèi)精密度和日間精密度都非常好。故采用該方法研究轉(zhuǎn)基因水稻及其親本作物在代謝水平上的差異。此外，還比較了不同播種時(shí)間和不同播種地點(diǎn)的水稻以評(píng)價(jià)環(huán)境因素可能產(chǎn)生的效應(yīng)。多元數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)不同播種地點(diǎn)的水稻存在代謝差異，并找到了對(duì)環(huán)境變化比較敏感的物質(zhì)甲煙酸內(nèi)鹽。結(jié)果表明對(duì)于多數(shù)代謝產(chǎn)物，如色氨酸、9,10,13-三羥基十八碳-11-烯酸、溶血磷脂酰乙醇胺（16∶0），環(huán)境因素比基因修飾起到了更大的作用。而對(duì)于植物鞘氨醇、棕櫚酸及其他3個(gè)未鑒定的代謝物，其含量的輕微變化更傾向于與基因修飾相關(guān)。其研究通過比較環(huán)境因素和基因修飾誘導(dǎo)的變化，表明由基因修飾引起的代謝物變化是否包含在環(huán)境因素導(dǎo)致的變化范圍之內(nèi)。

García López等[25]采用反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法（reversed-phase high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，RPHPLC-ESI-MS）對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。該方法具有靈敏度高，檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，這是第一次采用RP-HPLC-ESI-MS來分析玉米品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被測(cè)樣本之間存在一些相似性和差異性。Kim等[26]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（highperformance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD）和HPLC-MS研究轉(zhuǎn)基因中國白菜和非轉(zhuǎn)基因中國白菜的代謝指紋譜，沒有找到可以區(qū)分轉(zhuǎn)基因中國白菜與非轉(zhuǎn)基因中國白菜的差異代謝物。

3.2.3 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresismass spectrometry，CE-MS）

與其他類型聯(lián)用技術(shù)相比，CE-MS具有更高的分離速度和效率，且樣品和試劑消耗量少，分析速度快，近年來在代謝組學(xué)的研究中越來越受到重視[18,27]。

L e v a n d i等[28]采用毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜（capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry，CE-TOF-MS）來識(shí)別和定量3種轉(zhuǎn)基因玉米及其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因品種的主要代謝物。為了從玉米面中提取出數(shù)量最多的代謝物，提取過程中對(duì)超聲條件和溶劑選擇進(jìn)行了優(yōu)化。由于在線電噴霧-TOF-MS質(zhì)量精度非常好，識(shí)別代謝物精準(zhǔn)，故采用該手段識(shí)別代謝物。引入分子式到不同的數(shù)據(jù)庫中后，初步鑒定出27種代謝物。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米與其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因品種相比，有一些代謝物有顯著性差異，如L-肉堿和水蘇堿，這些差異代謝物可能是轉(zhuǎn)基因玉米的生物標(biāo)志物。在一個(gè)類似的研究中，García-Villalba等[29]采用同樣的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的代謝譜進(jìn)行了比較分析，該方法初步鑒定出40多種代謝物。結(jié)果表明所檢測(cè)到的代謝物中有一些沒有發(fā)生變化，而另一些在轉(zhuǎn)基因大豆與傳統(tǒng)品種中表現(xiàn)出了顯著性差異。

3.2.4 多平臺(tái)方法

多種代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)相結(jié)合的方法在代謝組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到青睞。這種多平臺(tái)方法可以對(duì)代謝組進(jìn)行全面檢測(cè)，并可為人們理解生物系統(tǒng)中差異代謝譜的意義提供有價(jià)值的信息。

Leon等[30]采用CE-TOF-MS和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法（Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）結(jié)合的方法研究了3種轉(zhuǎn)基因玉米及其對(duì)應(yīng)的野生型品種的代謝差異。上機(jī)之前采用加壓溶劑萃?。╬ressurized liquid extraction，PLE）對(duì)被測(cè)物品進(jìn)行提取和分離。由于FT-ICR-MS不能區(qū)分不同異構(gòu)體之間的結(jié)構(gòu)，所以采用CE-TOF-MS對(duì)化合物進(jìn)行識(shí)別，兩者的結(jié)合大大提高了篩選新的生物標(biāo)志物的效率，并且FT-ICR-MS的超高分辨率和靈敏度剛好彌補(bǔ)了CE-TOF-MS重復(fù)性較差且靈敏度很低的缺點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型品種比較轉(zhuǎn)基因品種的某些代謝途徑被改變，存在代謝差異。這是首次報(bào)道采用CE-TOF-MS，F(xiàn)T-ICR-MS和PLE三者結(jié)合的方法研究轉(zhuǎn)基因作物。為了研究轉(zhuǎn)基因番木瓜的潛在非預(yù)期成分變化，Jiao Zhe等[31]采用HPLC，GC-MS和LC-MS對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜和非轉(zhuǎn)基因番木瓜的一些特定成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)二者的這些特定成分含量相似，但是不同時(shí)期收獲的木瓜表現(xiàn)出更高程度的成分變化。此外，Jiao Zhe等[32]還采用近紅外光譜法（near-infrared reflectance，NIR）、GC-MS、HPLC和電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES）并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)3種抗逆轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)生了一些非預(yù)期的成分變化，營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、3種氨基酸、兩種脂肪酸、兩種維生素以及幾個(gè)元素都發(fā)生了不同程度的變化，而抗?fàn)I養(yǎng)因子肌醇六磷酸沒有顯著改變。Kusano等[33]也采用多平臺(tái)方法評(píng)估了轉(zhuǎn)基因番茄。為了減少化學(xué)偏倚，研究者通過GC-MS、LC-MS和CE-MS等多種儀器采集數(shù)據(jù)，沒有發(fā)現(xiàn)非預(yù)期的代謝變化。

4 結(jié) 語

代謝組學(xué)作為一種高通量、高靈敏度、高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期評(píng)價(jià)中，它可以為轉(zhuǎn)基因食品的安全性評(píng)價(jià)提供有力的科學(xué)依據(jù)。但是，代謝組學(xué)仍面臨著許多挑戰(zhàn)和亟待解決的關(guān)鍵問題。首先，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方面沒有一致性，很多已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于觀察到轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)作物存在差異性的研究都缺少生物驗(yàn)證，甚至沒有生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。因此，迫切需要建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范和報(bào)告實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析的細(xì)節(jié)[34-35]。其次，代謝組學(xué)的終極目標(biāo)是檢測(cè)鑒定機(jī)體內(nèi)的所有代謝產(chǎn)物，但目前所廣泛采用的儀器設(shè)備幾乎做不到這一點(diǎn)，即使能檢測(cè)到，往往也鑒定不了化學(xué)結(jié)構(gòu)。面臨這些瓶頸問題，開發(fā)靈敏度高、檢測(cè)范圍廣的檢測(cè)技術(shù)，建立并擴(kuò)展代謝產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)庫是代謝組學(xué)在未來的主要發(fā)展方向[36]。此外，任何一種組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的單獨(dú)使用提供的信息都是有限的，不同組學(xué)技術(shù)間的數(shù)據(jù)整合將會(huì)提供更多的信息，如何整合不同組學(xué)技術(shù)平臺(tái)和不同組學(xué)技術(shù)的數(shù)據(jù)將會(huì)是一個(gè)重要挑戰(zhàn)[37]。在以后的研究中，將需要更靈敏的技術(shù)以檢測(cè)更大范圍的非預(yù)期效應(yīng)。定向方法與非定向方法的結(jié)合可能會(huì)是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物生物安全性的更好的方法。

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Applications of Metabolomics in Evaluation of Unintended Effects of Genetically Modified Crops

WANG Sen, LI Jian-shuang, DU Xiao-yan*
(College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China)

Unintended effects from exogenous gene may form new metabolites or change metabolic patterns and nutrients of genetically modified crops, and even generate some new toxic substances. The study on unintended effects is one of the important contents of safety evaluation of genetically modified foods. This review focuses on the latest applications of metabolomics in evaluation of unintended effects of genetically modified crops, and describes research expectations in this field, so as to promote the development and improvement of safety evaluation system for genetically modified foods.

genetically modified crops; metabolomics/metabonomics; unintended effects; evaluation

TS201.6

A

1002-6630（2014）09-0312-05

10.7506/spkx1002-6630-201409061

2013-05-17

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國家重大科技專項(xiàng)（2011ZX08011-005）

王森（1984—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)技術(shù)及代謝組學(xué)。E-mail：644326653@163.com

*通信作者：杜曉燕（1954—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樯飩鞲衅骷吧?、食品檢驗(yàn)技術(shù)。E-mail：duxiaoyanha@163.com