趙經(jīng)緯，崔冠宇，王 瑩，吳成愛，何 達(dá)，田 偉

(1北京積水潭醫(yī)院，北京100035;2北京市創(chuàng)傷骨科研究所)

椎間盤退變是椎間盤退變性疾病(DDD)的病理基礎(chǔ)。組織工程技術(shù)著眼于利用生物學(xué)技術(shù)修復(fù)或者重建椎間盤生理結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，有望為DDD的治療提供新的選擇。種子細(xì)胞、細(xì)胞支架、細(xì)胞因子是椎間盤組織工程技術(shù)的三架馬車，細(xì)胞支架為細(xì)胞生長、增殖提供一個良好的環(huán)境，三維立體培養(yǎng)、可注射性細(xì)胞培養(yǎng)支架等為椎間盤組織工程技術(shù)提供了廣闊的空間。本文就椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料研究進(jìn)展綜述如下。

1 椎間盤組織工程支架的種類和特點

Maldonado等［1］于上世紀(jì)90年代首先利用藻酸鹽微球法成功培養(yǎng)人椎間盤細(xì)胞，20余年來，人們發(fā)展出多種方法，利用多種支架培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞。目前，常用的椎間盤組織工程支架可以按來源分為天然材料支架、人工合成材料支架和復(fù)合材料支架，也可以按照支架的主要材料成分進(jìn)行分類?？紤]到支架的性能不僅與材料本身相關(guān)，還與具體培養(yǎng)步驟有關(guān)，故本文在介紹不同材料的同時，對其經(jīng)典培養(yǎng)步驟進(jìn)行描述，以供參考。

1.1 藻酸鹽 藻酸鹽是從褐藻類細(xì)胞壁中提取出的一種線性天然高分子陰離子多糖，當(dāng)其遇到陽離子(Ca2+等)時發(fā)生偶聯(lián)化反應(yīng)，形成凝膠樣物質(zhì)，具有很好的溶膠—凝膠特性。早期多使用藻酸鹽微球的方法。Chelberg等［2］將髓核或纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)后，將細(xì)胞在含1.2%藻酸鹽的低黏度生理鹽水溶液中重新懸浮起來，制成1×106/mL的懸液，將懸液用23 G注射器在102 mmol/L CaCl2溶液上方滴入，并孵育10 min，形成藻酸鹽微球，用生理鹽水洗滌3遍，在加入抗生素與5%胎牛血清(FBS)的Ham's F-12培養(yǎng)液中進(jìn)行最終培養(yǎng)。Melrose等［3］對髓核細(xì)胞、移行區(qū)細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞用類似的方法成功進(jìn)行了椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)，并且發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞在藻酸鹽微球培養(yǎng)中可以進(jìn)行細(xì)胞分裂。藻酸鹽微球法是目前文獻(xiàn)中最為常見的椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)方法。Renani等［4］比較了藻酸鹽微球培養(yǎng)法與殼聚糖凝膠法培養(yǎng)的髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞在藻酸鹽微球中增殖的更好。但是Lee等［5］指出該法也存在一定弊端:微球的大小和品質(zhì)難以統(tǒng)一，使不同研究者結(jié)果難以比較;同時，每滴中的細(xì)胞數(shù)量難以嚴(yán)格控制，增大了實驗的不確定性;而區(qū)分細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)和藻酸鹽基質(zhì)也將變得非常繁瑣。

此外，藻酸鹽凝膠也可以用于椎間盤細(xì)胞的培養(yǎng)。Wang等［6］用藻酸鹽凝膠培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、軟骨終板細(xì)胞，并注入兔的椎間盤，再注入CaCl2進(jìn)行交聯(lián)。Guillaume等［7］在交聯(lián)藻酸鹽水凝膠的過程中增加一個凍干步驟，使凝膠變成多孔性，在TGF-β3刺激及低糖、低氧條件下培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞，纖維環(huán)細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白以及蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，和纖維環(huán)組織結(jié)構(gòu)類似。藻酸鹽還可以用來制成纖維支架，或者用藻酸鹽纖維交聯(lián)殼聚糖后進(jìn)行纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.2 殼聚糖 殼聚糖是甲殼素脫乙?；玫降囊环N天然高分子陽離子直鏈多糖，其結(jié)構(gòu)與糖胺聚糖分子結(jié)構(gòu)相似，具有良好的組織相容性。殼聚糖很少單獨用于椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)，多與甘油磷酸、京尼平、羥乙基纖維素交聯(lián)成復(fù)合支架用于椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)。Mwale 等［8］利用不同濃度(2.5%～10%)、不同種類的殼聚糖(氯化殼聚糖與谷氨酸殼聚糖)與不同濃度的京尼平交聯(lián)的復(fù)合支架培養(yǎng)人椎間盤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2.5%的谷氨酸殼聚糖-5%京尼平交聯(lián)支架最適合培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞，它在37℃迅速形成凝膠，培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞能保留95%活性，并且在注射入小鼠皮下后不引起炎癥反應(yīng)，注入椎間盤裂隙時不會漏出。Roughley等［9］橫向比較殼聚糖/京尼平、殼聚糖/甘油磷酸、殼聚糖/甘油磷酸/羥乙基纖維素支架培養(yǎng)牛髓核細(xì)胞效果，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞在各支架中均較好維持表型，產(chǎn)生大量蛋白多糖等ECM，且新生基質(zhì)均能保留在各種支架中，而不隨更換的培養(yǎng)液流失。目前，研究提示殼聚糖類支架更適合進(jìn)行髓核細(xì)胞培養(yǎng)，并且能夠用來制成溫敏型水凝膠進(jìn)行微創(chuàng)注射移植而具有巨大的潛力。殼聚糖/甘油磷酸制成的溫敏型水凝膠支架還可以誘導(dǎo)人類間充質(zhì)干細(xì)胞向人類髓核樣細(xì)胞分化。

1.3 瓊脂糖 瓊脂糖是從海藻中提取的線性多糖，是最常用的微生物培養(yǎng)固化劑。瓊脂也曾常用于軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)。Smith等［10］將牛髓核細(xì)胞經(jīng)過初步培養(yǎng)、傳代后，以2.0×107/mL細(xì)胞密度植入4%瓊脂糖中，并加入細(xì)胞因子進(jìn)行三維培養(yǎng)，所獲得的培養(yǎng)組織在功能、成分和分子特性上都與牛髓核組織相近。Iwata等［11］的研究結(jié)果表明，利用瓊脂糖水凝膠進(jìn)行犬髓核細(xì)胞三維培養(yǎng)時髓核細(xì)胞產(chǎn)生硫酸糖胺多糖、透明質(zhì)酸、Ⅱ型膠原纖維等ECM增加，但是細(xì)胞沒有增殖;Gruber等［12］的研究結(jié)果也表明，瓊脂凝膠培養(yǎng)的人椎間盤細(xì)胞增殖速度顯著低于膠原蛋白海綿培養(yǎng)，目前尚不明確其原因，可能由于瓊脂糖培養(yǎng)時產(chǎn)生的ECM較少，從而進(jìn)一步降低細(xì)胞—基質(zhì)相互作用，降低細(xì)胞增殖速度。

1.4 纖維蛋白凝膠 纖維蛋白凝膠是纖維蛋白原經(jīng)凝血酶激活形成的立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物凝膠，具有較高的生物相容性和較低的免疫原性，同時可以釋放血小板衍生生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子，利于椎間盤細(xì)胞的黏附、增殖以及分泌ECM。其培養(yǎng)過程為在牛纖維蛋白原新鮮制備的溶液中加入初步培養(yǎng)、傳代過的細(xì)胞并打散，取100 μL加入多孔培養(yǎng)小室中，同時加入11 μL滅菌凝血酶溶液，待凝膠凝結(jié)后置入孵育箱中［12］。Gruber等［12］利用此法培養(yǎng)的人纖維環(huán)細(xì)胞高倍鏡下呈梭形，周圍可見極少量基質(zhì)，且此法培養(yǎng)的間盤細(xì)胞僅表達(dá)Ⅰ、Ⅱ型膠原基因，沒有表達(dá)蛋白多糖及6-硫酸軟骨素產(chǎn)生所必須的軟骨素-6磺基轉(zhuǎn)移酶，認(rèn)為纖維蛋白凝膠不適于進(jìn)行椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)。Schek等［13］使用京尼平/纖維蛋白交聯(lián)凝膠培養(yǎng)人纖維環(huán)細(xì)胞，此時纖維環(huán)細(xì)胞呈圓形，在京尼平與纖維蛋白比例為0.5的凝膠可以觀察到明顯的纖維環(huán)細(xì)胞增殖。

1.5 膠原蛋白 膠原蛋白是椎間盤ECM的主要組成部分，故使用膠原蛋白作為支架能夠獲得較好的生物相容性和較低的免疫原性。膠原蛋白支架包括膠原蛋白凝膠、膠原/透明質(zhì)酸支架、膠原蛋白海綿等。

膠原蛋白凝膠:培養(yǎng)時使用純化的、胃蛋白酶消化的牛皮膚膠原蛋白的鹽酸溶液，在膠原蛋白凝結(jié)之前將初步培養(yǎng)、傳代過的人纖維環(huán)細(xì)胞分散置入其中，放于多孔培養(yǎng)小室中，置于孵育箱中培養(yǎng)［12］，此法培養(yǎng)的人纖維環(huán)細(xì)胞高倍鏡下呈梭形，周圍有少量ECM。

膠原/透明質(zhì)酸支架:Alini等［14］利用Ⅰ型膠原/透明質(zhì)酸支架培養(yǎng)牛髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞能夠保留活性，分泌蛋白多糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原。但此種支架的主要局限性表現(xiàn)在更換培養(yǎng)液時ECM丟失較多，并且ECM難以均勻散布于支架內(nèi)部。Calderon等［15］利用Ⅱ型膠原/透明質(zhì)酸支架培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在支架中存活良好并向軟骨細(xì)胞分化。Li等［16］發(fā)現(xiàn)用1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳二亞胺和N-羥基琥珀酼亞胺交聯(lián)Ⅱ型膠原/透明質(zhì)酸/6-硫酸軟骨素支架后支架的孔隙率以及結(jié)合水的能力增加，變性溫度提高，具有良好的組織相容性，適用于髓核細(xì)胞培養(yǎng)。并且將該支架培養(yǎng)同種異體髓核細(xì)胞植入到接受髓核切除術(shù)的兔椎間盤內(nèi)，觀察24周發(fā)現(xiàn)其椎間盤退變程度明顯低于單純切除術(shù)組。

膠原蛋白海綿:Gruber等［17］將人纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行初步培養(yǎng)、傳代，置于加有20%FBS的最小需求培養(yǎng)液中。膠原蛋白海綿采用自豬皮膚凝膠顆粒提純的可吸收膠原海綿，裁成0.5 cm3大小的立方體，每個立方體注入含10萬細(xì)胞的的上述培養(yǎng)液，將多個膠原蛋白海綿立方置入多孔培養(yǎng)小室，用2 mL 20%FBS液浸濕，放入孵育箱中孵育14 d，其間間斷更新培養(yǎng)液。發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)細(xì)胞能夠保留活性，產(chǎn)生較多ECM成分。

Gruber等［12］使用膠原蛋白海綿、藻酸鹽、瓊脂、膠原蛋白凝膠、纖維蛋白凝膠等不同支架以及單層培養(yǎng)對人纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對細(xì)胞增殖、分泌ECM和基因表達(dá)等方面進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白海綿支架中培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞能夠產(chǎn)生最多的ECM，其次是膠原蛋白凝膠支架，而纖維蛋白凝膠中幾乎沒有ECM產(chǎn)生。膠原蛋白海綿支架中的細(xì)胞數(shù)量多，常呈圓形，免疫組化顯示細(xì)胞旁有大量Ⅱ型膠原產(chǎn)生。另有研究顯示，膠原蛋白海綿法細(xì)胞增殖速度明顯快于大部分其他培養(yǎng)方法，而藻酸鹽培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度最低。膠原蛋白海綿提供了多孔的微環(huán)境，使細(xì)胞能夠產(chǎn)生豐富的ECM。海綿樣結(jié)構(gòu)使細(xì)胞易于黏附，其多孔性可能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物更易彌散，同時為新生細(xì)胞和ECM提供足夠的空間。

1.6 去端肽膠原 去端肽膠原是用胃蛋白酶將膠原上的抗原決定簇消化后形成的一種變性膠原，故其抗原性更小，植入時安全性更高。去端肽膠原在4℃時為液態(tài)，在37℃時變?yōu)槟z態(tài)。根據(jù)取材來源不同，去端肽膠原也可制作成與膠原對應(yīng)的Ⅰ～Ⅳ型。Sakai等［18］利用不同濃度的Ⅰ、Ⅱ型去端肽膠原作為支架培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)去端肽膠原培養(yǎng)的細(xì)胞DNA合成顯著高于藻酸鹽組，低濃度去端肽膠原中細(xì)胞合成的蛋白多糖顯著高于藻酸鹽組。Halloran等［19］利用可注射型Ⅱ型去端肽膠原作為支架培養(yǎng)牛髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶交聯(lián)的去端肽膠原/透明質(zhì)酸共聚物能夠保留更多的ECM，并且其結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。Sato等［20］利用高強度膜封的Ⅰ型去端肽膠原蜂巢樣支架培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠維持表形，保留較強的分泌ECM的能力;將支架—細(xì)胞復(fù)合體同種異體植入兔間盤退變模型中，觀察12周，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和分泌ECM均高于對照組，椎間隙狹窄明顯遲于對照組。

1.7 硫酸軟骨素 硫酸軟骨素是糖胺多糖的一種，是椎間盤ECM的重要組成成分，所以具有較高生物相容性及較低免疫原性。硫酸軟骨素不能單獨用于椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)，前面已經(jīng)提到硫酸軟骨素復(fù)合支架［16］。Yang 等［21］利用凝膠/6-硫酸軟骨素復(fù)合支架及凝膠/6-硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸復(fù)合支架培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠分泌 ECM并表達(dá)多種ECM相關(guān)基因，適用于髓核組織的再生研究。Bhattacharjee等［22］用絲素蛋白交聯(lián)硫酸軟骨素支架動態(tài)培養(yǎng)羊軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)復(fù)合體內(nèi)部富含Ⅰ型膠原和蛋白多糖，抗壓能力強;外周區(qū)域富含Ⅱ型膠原，抗拉伸能力強;作者分析該培養(yǎng)復(fù)合體模擬椎間盤的結(jié)構(gòu)和功能。

1.8 透明質(zhì)酸 一種酸性黏多糖，在體內(nèi)可由纖維母細(xì)胞合成，具有良好的組織相容性。Crevensten等［23］將透明質(zhì)酸凝膠與間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后移植至加壓的鼠椎間盤內(nèi)，1、2周后椎間盤內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量明顯減少，到4周后間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量明顯增加，和空白組對比，合成ECM增加并增加椎間盤高度。這是目前惟一單獨使用透明質(zhì)酸作為支架材料的報道，其余均為利用透明質(zhì)酸作為一種成分組成椎間盤培養(yǎng)的復(fù)合支架［15～18，23］。

1.9 組織脫細(xì)胞支架 組織脫細(xì)胞支架是通過化學(xué)洗滌方法、超聲等物理方法結(jié)合生物酶等生物方法去除組織中的細(xì)胞和抗原成分，保留ECM作為支架材料。Chan等［24］將牛的完整椎間盤(終板到終板)脫細(xì)胞后，椎間盤仍然保持其蛋白多糖和膠原的結(jié)構(gòu)以及其生物力學(xué)性能，髓核細(xì)胞種植到其中的脫細(xì)胞髓核組織后細(xì)胞存活、增殖良好。Mercurri等［25］通過乙二胺四乙酸等化學(xué)洗滌劑、超聲和核酸酶去除豬髓核組織中的細(xì)胞和豬αGal抗原制成脫細(xì)胞髓核凝膠，其生物力學(xué)性能和髓核組織相近，用來培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞，結(jié)果顯示人脂肪干細(xì)胞在該支架中生存和增殖良好。該支架培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞后組織黏彈性增加，細(xì)胞表達(dá)髓核細(xì)胞所表達(dá)的基因，植入小鼠皮下沒有引起異物反應(yīng)。

1.10 聚乳酸(PLLA)、聚羥基乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)PLLA、PGA、PLGA是一類人工合成的高分子材料，具有良好的生物相容性，可在體內(nèi)降解。Mizuno等［26］將PLLA和PGA支架制成纖維環(huán)形狀，培養(yǎng)羊纖維環(huán)細(xì)胞，然后在纖維環(huán)支架中間空隙處置入藻酸鹽—髓核細(xì)胞復(fù)合物，形成模擬的纖維環(huán)—髓核復(fù)合體;復(fù)合培養(yǎng)1 d后，植入裸鼠皮下，16周后形成大體形態(tài)、組織學(xué)、生化成分和機械性能均接近天然的間盤組織形態(tài)。但有研究表明，這些材料植入體內(nèi)會產(chǎn)生大量巨細(xì)胞持續(xù)性反應(yīng)，這種強烈炎癥反應(yīng)對于后續(xù)的體內(nèi)植入實驗不利［13］;Razaq等［27］發(fā)現(xiàn)，此類材料體內(nèi)降解時釋放酸性物質(zhì)引起的pH降低會抑制間盤細(xì)胞合成GAG等物質(zhì)的能力。Vadalà 等［28］利用可釋放 TGF-β1的電紡 PLLA 支架培養(yǎng)牛纖維環(huán)細(xì)胞比普通電紡PLLA支架培養(yǎng)釋放更多的蛋白多糖、膠原纖維等ECM。

1.11 聚磷酸鈣 聚磷酸鈣是一種以磷酸鈣/磷酸二氫鈣為主要原料通過分子間縮聚反應(yīng)而生成的一種骨替代材料。Séguin等［29］將牛髓核細(xì)胞種植于多孔聚磷酸鈣材料表面培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)材料表面形成髓核樣組織，并且其膠原、蛋白聚糖含量以及生物力學(xué)性能與髓核組織相近。Hamilton等［30］通過牛髓核細(xì)胞種植于多孔聚磷酸鈣材料表面培養(yǎng)，并與體外培養(yǎng)的軟骨組織形成髓核/軟骨終板/聚磷酸鈣的三相結(jié)構(gòu)，探索用于椎間盤置換。但聚磷酸鈣脆性較大，降解不易控制，可能限制其應(yīng)用范圍。

除以上較為常用的支架材料，還有部分研究者利用其他支架培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞，如尼龍納米纖維支架、多孔絲支架、小腸黏膜下層、光交聯(lián)的羧甲基纖維素水凝膠等，因使用者較少，本文暫不展開論述。

2 問題與展望

組織工程學(xué)研究需要合適的細(xì)胞培養(yǎng)支架，要求支架材料具有良好的生物相容性及生物降解性、適當(dāng)?shù)膹姸群涂伤苄?、良好的材料—?xì)胞界面、三維立體多孔結(jié)構(gòu)等。椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)的最佳方法目前仍在不斷探索之中。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，各種新支架不斷被開發(fā)出來。在探索新支架材料上，一方面可以將其他器官組織工程正在應(yīng)用的支架材料拓展到椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)，另一方面，可在現(xiàn)有材料基礎(chǔ)上，進(jìn)行各種已知材料的混合、交聯(lián)，如本文中提到的各種殼聚糖交聯(lián)支架、硫酸軟骨素復(fù)合支架、在支架材料中加入緩釋的細(xì)胞因子等，探究新的混合方式與比例，尋找最適合椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架可能是未來發(fā)展的重要方向。進(jìn)行體外組織工程最重要的目的之一是植入體內(nèi)以實現(xiàn)治療目的，因此，探究支架植入體內(nèi)后與機體相互作用具有重要意義。目前，應(yīng)用支架體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究較多，而將支架—細(xì)胞復(fù)合物植入體內(nèi)的研究相對缺乏，也是未來的研究方向。應(yīng)用不同支架分別培養(yǎng)纖維環(huán)、髓核細(xì)胞，在體外構(gòu)建組織工程人工椎間盤，為今后的組織修復(fù)甚至器官置換提供了新的思路。

各種材料橫向比較，藻酸鹽支架應(yīng)用時間最長、應(yīng)用最多;其次為殼聚糖支架，磷酸鈣、瓊脂、膠原凝膠培養(yǎng)與膠原海綿相比并無優(yōu)勢;單純的纖維蛋白及透明質(zhì)酸凝膠不太適用于椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)，而利用它們構(gòu)建的復(fù)合支架則可以用來培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞;膠原海綿、去端肽膠原、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細(xì)胞支架在椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用正在不斷完善;更多的細(xì)胞培養(yǎng)材料不斷被開發(fā)出來。目前仍需更多實踐比較不同支架的優(yōu)劣與適用范圍?？勺⑸湫约?xì)胞支架是一個很有吸引力的研究方向，因為它可以應(yīng)用到微創(chuàng)方法治療椎間盤退變。藻酸鹽、殼聚糖支架、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等材料都可以用來制成可注射性細(xì)胞支架。

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