劉思玉 謝龍 祁兵 馬長艷 桑磊 李宏衛(wèi)

1.南京醫(yī)科大學口腔醫(yī)學研究所；2.南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科；3.病理科；4.南京醫(yī)科大學細胞生物學與醫(yī)學遺傳學系，南京 210029

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是頭頸部惡性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其易發(fā)生細胞侵襲和轉移，患者預后較差，術后5年的存活率低于50%[1]。研究[2]發(fā)現：OSCC的發(fā)生和發(fā)展受基因水平的調控，基因表達受DNA水平、轉錄水平、轉錄后水平及蛋白水平等多層面調控，過程復雜。近年來，微小RNA（microRNAs，miRNA）在轉錄后水平對基因表達的精細調控備受關注。大量研究[3-4]表明miRNA既可作為原癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，又可作為抑癌基因參與抑制惡性腫瘤的形成，其在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及機體發(fā)育、代謝等基本生命活動過程中發(fā)揮重要作用，并可以作為OSCC早期診斷和治療的生物標志物[5]。

據估計，人類基因組中miRNA的種類約有1 000多種，其在基因轉錄后通過抑制靶mRNA的翻譯或降解mRNA調控近30%的人類基因[6]。因此，了解OSCC發(fā)生和發(fā)展相關的遺傳過程及參與的生物學通路，為疾病的分級、早期診斷及治療提供重要的信息，對新藥的開發(fā)也有很大幫助[7-8]。因此，OSCC中差異miRNA/mRNA表達譜的對接研究顯得尤為重要。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

選取10對凍存OSCC組織和配對癌旁正常組織作為研究對象，樣本來源于2011年11月—2012年2月期間在江蘇省口腔醫(yī)院頜面外科接受手術治療的OSCC患者，術前已經專業(yè)病理人員確診為OSCC，且所有患者并未接受過任何放化療或其他抗癌治療，并獲得每位患者書面同意。癌旁正常組織定義為病灶周圍病理檢查未見OSCC細胞的組織。樣本經手術切除后立即于-80 ℃凍存收集。

1.2 構建差異miRNA表達譜

從OSCC樣本和配對癌旁的樣本中分別提取總RNA，回收18～30 nt大小的片段，通過逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）構建兩組樣本的cDNA文庫。運用Illumina HiSeq 2000第二代高通量測序技術對兩組樣本的miRNA進行測序，通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數據的處理，得到最終數據。參照miRNA數據庫，比對已知miRNA，構建OSCC組織和配對癌旁組織的miRNA表達譜。將兩個樣本的miRNA表達量歸一化到同一個量級，然后使用標準化后的結果比較分析兩組樣本中顯著差異表達的miRNA，顯著差異表達的miRNA定義為Fold-change（log2鱗癌/癌旁）＞1或者Fold-change（log2鱗癌/癌旁） ＜-1，并且P＜0.01。

1.3 構建差異mRNA表達譜

OSCC組織和配對癌旁組織的mRNA表達譜的構建方法同miRNA表達譜。差異基因的檢測方法參照文獻[9]，顯著差異表達基因定義為Fold-change（log2鱗癌/癌旁）≥1或Fold-change（log2鱗癌/癌旁）≤-1，且發(fā)現錯誤率（false discovery rate，FDR）≤0.001。

1.4 OSCC和癌旁組織中差異表達miRNA/mRNA對接

運用Gene Ontology功能富集分析，將1.2和1.3的結果進行對接分析，預測與OSCC細胞周期、凋亡、增殖及分化相關性較高的miRNA和mRNA。

2 結果

2.1 OSCC和癌旁組織中差異miRNA表達譜

2.1.1 已知miRNA的統(tǒng)計 與人類miRNA數據庫中的miRNA前體進行比對發(fā)現，在OSCC組織中，共檢測到1 554個已知miRNA，包括255個miRNA成熟體，304個miRNA-3p，283個miRNA-5p，712個miRNA前體；在癌旁組織中，共檢測到1 496個已知miRNA，其中有247個miRNA成熟體，297個miRNA-3p，268個miRNA-5p和684個miRNA前體。

2.1.2 OSCC和癌旁組織中差異表達的miRNA 對照OSCC和癌旁組織中已知的miRNA，共有77個miRNA顯著性差異表達，其中53個顯著性上調，24個顯著性下調。上調表達最顯著的10個miRNA分別為hsamiR-448、hsa-miR-1269b、hsa-miR-184、hsa-miR-411-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-10b-3p、hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-450b-5p、hsamiR-409-5p，Fold-change（log2鱗癌/癌旁）分別為10.746 02、8.070 44、7.807 41、6.707 91、4.891 40、3.980 21、3.680 66、3.439 63、2.838 23、2.565 21；下調表達最顯著的10個miRNA分別為hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-96-3p、hsa-miR-676-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-4776-5p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-1323，Foldchange（log2鱗癌/癌旁）分別為-8.007 87、-6.920 41、-6.727 78、-3.751 05、-2.967 36、-2.958 51、-2.720 37、-2.341 79、-2.064 27、-1.894 38。

2.2 OSCC和癌旁組織中差異mRNA表達譜

在OSCC組織和癌旁組織中共發(fā)現1 298個mRNA差異表達，根據篩選標準，發(fā)現1 120個mRNA顯著性上調，178個mRNA顯著性下調。上調表達最顯著的10個mRNA分別為MAGE-A11、PHACTR3、COL10A1、PPAPDC1A、EMR1、FAM132A、CHRNA1、LRRC17、ODZ3、BAALC，Fold-change（log2鱗癌/癌旁）分別為10.252 66、9.930 73、9.837 62、9.738 09、9.686 50、9.686 50、9.686 50、9.631 17、9.455 32、9.324 18；下調表達最顯著的10個mRNA分別為TCHH、SYTL4、EPHX3、KRT33B、CTTNBP2、ESYT3、NCRNA-00162、SYTL5、CACNB4、CRTAC1，Fold-change（log2鱗癌/癌旁）分別-10.759 88、-9.607 33、-9.377 21、-8.939 57、-8.851 74、-8.758 22、-8.758 22、-8.758 22、-8.758 22、-8.661 77。

2.3 OSCC組織中差異表達miRNA/mRNA的對接研究

除了上調表達中的miR-1537、miR-20a-5p和下調表達中的miR-23b-5p、hsa-miR-210未尋找到相應調控的靶mRNA外，其余73個miRNA都在OSCC細胞周期、增殖、分化及凋亡過程中相應地調控一個或多個靶mRNA。

3 討論

高通量測序技術堪稱測序技術發(fā)展歷程的一個里程碑，該技術可以對數百萬個遺傳分子同時進行測序，這使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。近年來，以Illumina公司的Solexa技術、ABI公司的SOLiD技術和Roche公司的454技術為代表的新一代高通量RNA測序（RNA Sequencing，RNA-seq）技術得到飛速發(fā)展[10-11]，與基因芯片技術相比，RNA-seq無需設計探針，能在全基因組范圍內以單堿基分辨率檢測和量化轉錄片段，并能應用于基因組圖譜尚未完成的物種，具有信噪比高、分辨率高、應用范圍廣等優(yōu)勢[12]。此技術已在肝癌、膀胱癌等常見癌的表達譜構建方面得到廣泛應用[13-14]，但在OSCC表達譜構建方面的報道鮮見。本研究首次構建了OSCC的差異miRNA和mRNA表達譜，在該領域內具有先進性。

腫瘤細胞的周期改變、增殖、分化以及凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，受到基因水平的調控，OSCC也同樣如此。如S100A14的過表達，中止了OSCC細胞在G1期的有絲分裂，從而抑制了腫瘤的生長[15]；PLAU的高表達與OSCC的細胞增殖相關，已成為OSCC預后診斷的指標[16]；與凋亡相關的基因BCL2L12，與鱗癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關[17]。

從對接研究結果來看，在細胞周期、增殖、分化和凋亡4個階段，一個miRNA可以調控多個mRNA，如上調表達的miR-377-3p、miR-450a-3p、miR-424-5p等和下調表達的miR-96-3p、let-7c、miR-548h-5p等。同樣，也發(fā)現一個mRNA被多個miRNA調控，預測這些差異表達的miRNA在OSCC的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定的作用。如miRNA-184在舌鱗癌患者中表達上調，手術切除后明顯減少[18]；miRNA-10b在口腔癌中高表達，其可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[19]；miR-9在頭頸部鱗癌中高表達，其通過抑制腫瘤細胞的增殖發(fā)揮抑癌作用[20]；在OSCC中下調表達的miRNA-99a同腫瘤的生長密切相關[21]；下調表達的miR-125b在OSCC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著作用[22]；miR-375在頭頸部鱗癌中低表達[23]。

miRNA-21、miRNA-31等一些已報道的口腔鱗癌相關miRNA[24-25]，在研究中雖然也表現出一定的差異性，但是并不是很顯著。此現象出現可能因選取的檢測方法較以往研究不同，本研究采用高通量測序技術，獲得龐大而詳實的OSCC差異miRNA表達譜，較前可能會存在一定差異；其次可能因本研究的樣本量偏少，導致結果有一些細微偏差，但并不影響整體的實驗結果，筆者會在后續(xù)的研究中繼續(xù)增加樣本數量。

通過對OSCC和癌旁組織中miRNA和mRNA的對接研究，對miRNA與mRNA在OSCC中的相關關系有了更加深入的認識：單個miRNA可調控多個mRNA，一個mRNA同時又可受到多個miRNA的調控，它們相互交織、相互合作，形成精密、復雜的網絡參與轉錄后的基因表達調控，在OSCC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。隨著OSCC中特異性miRNA的不斷發(fā)現，通過生物信息技術，預測與之對應的靶基因，并對參與OSCC信號轉導通路中的靶基因進行驗證，對OSCC早期診斷和治療提出了一些新的思路和方法。

[1]Brocklehurst PR, Baker SR, Speight PM. Oral cancer screening: what have we learnt and what is there still to achieve[J].Future Oncol, 2010, 6(2):299-304.

[2]Williams HK. Molecular pathogenesis of oral squamous carcinoma[J]. Mol Pathol, 2000, 53(4):165-172.

[3]Kong YW, Ferland-McCollough D, Jackson TJ, et al. micro-RNAs in cancer management[J]. Lancet Oncol, 2012, 13(6):e249-e258.

[4]Lopez-Camarillo C, Marchat LA, Arechaga-Ocampo E, et al. MetastamiRs: non-coding microRNAs driving cancer invasion and metastasis[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(2):1347-1379.

[5]Heneghan HM, Miller N, Kerin MJ. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer[J]. Curr Opin Pharmacol,2010, 10(5):543-550.

[6]Visone R, Croce CM. MiRNAs and cancer[J]. Am J Pathol,2009, 174(4):1131-1138.

[7]Nagpal JK, Das BR. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management[J]. Oral Oncol, 2003, 39(3):213-221.

[8]Reibel J. Prognosis of oral pre-malignant lesions: signi fi -cance of clinical, histopathological, and molecular biological characteristics[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 2003, 14(1):47-62.

[9]Bos CL, van Baarsen LG, Timmer TC, et al. Molecular subtypes of systemic sclerosis in association with anti-centromere antibodies and digital ulcers[J]. Genes Immun, 2009, 10(3):210-218.

[10]Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(1):31-46.

[11]Marioni JC, Mason CE, Mane SM, et al. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays[J]. Genome Res, 2008, 18(9):1509-1517.

[12]Birzele F, Schaub J, Rust W, et al. Into the unknown: expression profiling without genome sequence information in CHO by next generation sequencing[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(12):3999-4010.

[13]Zhu J, Jiang Z, Gao F, et al. A systematic analysis on DNA methylation and the expression of both mRNA and micro-RNA in bladder cancer[J]. PLoS ONE, 2011, 6(11):e28223.

[14]Li X, Chen J, Hu X, et al. Comparative mRNA and micro-RNA expression profiling of three genitourinary cancers reveals common hallmarks and cancer-speci fi c molecular events[J]. PLoS ONE, 2011, 6(7):e22570.

[15]Sapkota D, Costea DE, Bl? M, et al. S100A14 inhibits proliferation of oral carcinoma derived cells through G1-arrest[J]. Oral Oncol, 2012, 48(3):219-225.

[16]Hundsdorfer B, Zeilhofer HF, Bock KP, et al. Tumour-associated urokinase-type plasminogen activator (uPA)and its inhibitor PAI-1 in normal and neoplastic tissues of patients with squamous cell cancer of the oral cavity-clinical relevance and prognostic value[J]. J Craniomaxillofac Surg,2005, 33(3):191-196.

[17]Geomela PA, Kontos CK, Yiotakis I, et al. Quantitative expression analysis of the apoptosis-related gene, BCL2L12,in head and neck squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med, 2013, 42(2):154-161.

[18]Wong TS, Liu XB, Wong BY, et al. Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA of squamous cell carcinoma of tongue[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(9):2588-2592.

[19]Lu YC, Chen YJ, Wang HM, et al. Oncogenic function and early detection potential of miRNA-10b in oral cancer as identi fi ed by microRNA pro fi ling[J]. Cancer Prev Res: Phila,2012, 5(4):665-674.

[20]Minor J, Wang X, Zhang F, et al. Methylation of micro-RNA-9 is a speci fi c and sensitive biomarker for oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas[J]. Oral Oncol,2012, 48(1):73-78.

[21]Yan B, Fu Q, Lai L, et al. Downregulation of microRNA 99a in oral squamous cell carcinomas contributes to the growth and survival of oral cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(3):675-681.

[22]Henson BJ, Bhattacharjee S, O’Dee DM, et al. Decreased expression of miR-125b and miR-100 in oral cancer cells contributes to malignancy[J]. Genes Chromosomes Cancer,2009, 48(7):569-582.

[23]Harris T, Jimenez L, Kawachi N, et al. Low-level expression of miR-375 correlates with poor outcome and metastasis while altering the invasive properties of head and neck squamous cell carcinomas[J]. Am J Pathol, 2012, 180(3):917-928.

[24]Wang W, Songlin P, Sun Y, et al. miR-21 inhibitor sensitizes human OSCC cells to cisplatin[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(5):5481-5485.

[25]Liu CJ, Lin SC, Yang CC, et al. Exploiting salivary miR-31 as a clinical biomarker of oral squamous cell carcinoma[J].Head Neck, 2012, 34(2):219-224.