熊 慧，張阿偉，范貴民，扈清云

（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007）

直結(jié)腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了一系列組織學(xué)變化的過(guò)程，每一個(gè)階段都伴隨著特定的遺傳變異。一般來(lái)說(shuō)，直結(jié)腸腫瘤的形成需要兩個(gè)必要條件，一是存在一個(gè)適合早期突變細(xì)胞無(wú)限克隆擴(kuò)增的環(huán)境，二是腫瘤相關(guān)基因的不穩(wěn)定性。KRAS基因突變的常見方式為點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)好發(fā)于1號(hào)外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞癌變，已有研究表明p21蛋白誘發(fā)直結(jié)腸癌。DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內(nèi)多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細(xì)胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當(dāng)抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細(xì)胞生長(zhǎng)及分化發(fā)生障礙，此時(shí)細(xì)胞即可發(fā)生惡變。本研究采用免疫組織化學(xué)法，我們將同步檢測(cè)68例直結(jié)腸癌中癌基因KRAS和抑癌基因DCC的表達(dá)情況，以期找到它們之間的相關(guān)性，為直結(jié)腸癌的早期無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)性診斷提供一定的理論依據(jù)。K-RAS和DCC表達(dá)是否與腫瘤組織分型、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是否可作為判斷直結(jié)腸癌生物學(xué)行為的一個(gè)指標(biāo)，從而為直結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的生物學(xué)標(biāo)記和腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011～2013年手術(shù)切除的直結(jié)腸癌組織標(biāo)本68例，直腸癌標(biāo)本中男44例，女24例，31～80歲，平均58.5歲。良性病變組織標(biāo)本45例，均為明確診斷病例，組織樣本及時(shí)用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片厚4～5μm，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 主要試劑

K-RAS、DCC兔來(lái)源多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，采用該公司SP系列免疫組化試劑盒檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用SP試劑盒法，按說(shuō)明步驟處理，一抗分別為K-RAS、DCC兔來(lái)源多克隆抗體，工作濃度為1：200，滴加后4℃冰箱孵育過(guò)夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定

K-RAS陽(yáng)性細(xì)胞分步彌散，染色位于包膜和胞質(zhì)；DCC蛋白陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以上染色均呈棕黃色細(xì)顆粒狀。判斷標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡鏡下（×100）5個(gè)視野中平均陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，＞10%的癌細(xì)胞胞質(zhì)中或包膜呈棕黃色，淺黃色者定為弱陽(yáng)性，計(jì)入陽(yáng)性［1］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 K-RAS在直結(jié)腸癌中及良性病變組織的表達(dá)

68例直結(jié)腸癌病例中，K-RAS表達(dá)陽(yáng)性42例，陽(yáng)性率為61.8%，其中腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織學(xué)類型的表達(dá)率差異不顯著，45例良性病變組織中，KRAS表達(dá)陽(yáng)性14例，陽(yáng)性率為31.1%。直結(jié)腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 DCC在良性病變組織及直結(jié)腸癌中的表達(dá)

68例直結(jié)腸癌病例中，DCC表達(dá)陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率為7.4%，45例良性病變組織中，DCC表達(dá)陽(yáng)性41例，陽(yáng)性率為91.1%。直結(jié)腸癌病例中，不同臨床病理特征表達(dá)陽(yáng)性率差異不顯著。直結(jié)腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P ＜0.01）。

3 討論

Ras基因在人類的第12號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)，在5'端包含4個(gè)編碼區(qū)外顯子和1個(gè)非編碼區(qū)外顯子，能夠編碼含189個(gè)氨基酸組成的ras蛋白，其相對(duì)分子量為21×103，故命名為p21蛋白。K-RAS基因突變的常見方式為點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)好發(fā)于1號(hào)外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞癌變［2］，K-RAS的基因突變時(shí)，鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性降低，p21蛋白GTP結(jié)合牢固，不易被GTPase水解，p21蛋白長(zhǎng)期處于激活狀態(tài)，進(jìn)而持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，最終誘發(fā)大腸癌［3］。在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者中發(fā)現(xiàn)RAS基因的擴(kuò)增［4］，研究表明，K-RAS基因過(guò)表達(dá)明顯降低自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）對(duì)腫瘤的殺傷作用，可作為大腸癌轉(zhuǎn)移，病情惡化的特征［5］。本研究中，K-RAS在直結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，對(duì)于直結(jié)腸癌的臨床診斷有一定的意義，因此，我們認(rèn)為，如果在直結(jié)腸病變組織中檢測(cè)K-RAS蛋白，則有利于直結(jié)腸癌的早期診斷，進(jìn)一步研究未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與直結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，這與已有研究報(bào)道一致［6］。

DCC基因位于18號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)1400kb，包含29個(gè)外顯子，能夠編碼含1447個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內(nèi)多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細(xì)胞粘附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當(dāng)抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細(xì)胞生長(zhǎng)及分化發(fā)生障礙，此時(shí)細(xì)胞即可發(fā)生惡變［4］。研究表明，DCC基因失活與直結(jié)腸癌的浸潤(rùn)程度及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［9］，本研究中，DCC蛋白在直結(jié)腸癌中缺失率為92.6%，DCC的編碼產(chǎn)物與黏附分子具有同源性，它的缺失應(yīng)該會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力，但我們未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，其相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究揭示。相應(yīng)DCC蛋白的缺失率明顯增加，我們認(rèn)為這對(duì)于研究直結(jié)腸癌的演變及進(jìn)展具有重要意義。盡管目前對(duì)K-RAS和DCC基因的研究有了很大的進(jìn)步，但是關(guān)于K-RAS和DCC基因的失活機(jī)制、K-RAS和DCC蛋白的功能、K-RAS和DCC基因與其它基因是如何協(xié)同作用與直結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中K-RAS和DCC基因誘導(dǎo)細(xì)胞分化的機(jī)制尚未完全清楚。K-RAS基因失活的同時(shí)DCC蛋白表達(dá)缺失是否能夠用于指導(dǎo)臨床早期診斷，是否關(guān)系直結(jié)腸癌腫瘤組織病理分型、腫瘤分期仍待于進(jìn)一步探究。腫瘤發(fā)生可能是癌基因突變和抑癌基因失活共同作用的結(jié)果，目前尚無(wú)報(bào)道聯(lián)合檢測(cè)K-RAS和DCC表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)在直腸癌組織中，K-RAS呈高表達(dá)，DCC則呈缺失表達(dá)，從而我們認(rèn)為以上兩種因素的協(xié)同調(diào)控直結(jié)腸癌的發(fā)生，K-RAS基因突變和DCC基因表達(dá)缺失與直結(jié)腸癌的發(fā)生關(guān)系密切，能夠在分子水平判斷直結(jié)腸癌生物學(xué)行為。這為直結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的生物學(xué)標(biāo)記和腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。

［1］仇容，陳增良，司馬軍，等.DCC、P53及VEGF在結(jié)直腸腺癌癌組織中的表達(dá)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，8

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