王艷鳳，王 楠，丁 靜，孫 堯，劉曉雷，王學(xué)林，劉明遠，白 雪

旋毛蟲病是由旋毛蟲(Trichinella)引起的一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病，因食入含有旋毛蟲感染性肌幼蟲的生的或半生的肉類引起。旋毛蟲在感染不同時期，釋放許多生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)并入侵宿主肌細胞為自己構(gòu)建了一個安全的包囊來達到成功的寄生。包囊的形成是一個復(fù)雜的過程，其排泄分泌物及其誘導(dǎo)宿主細胞釋放的效應(yīng)分子在感染肌細胞的轉(zhuǎn)換及其周圍環(huán)境的改變中發(fā)揮著重要的作用[1]。體外實驗表明，旋毛蟲肌幼蟲蟲體粗提物能夠刺激巨噬細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維生長因子2(FGF2)，其中VEGF可能與維持保姆細胞(nurse cells)的低氧環(huán)境及刺激釋放I型膠原的纖維母細胞的增殖有關(guān)，這些結(jié)果表明旋毛蟲感染肌細胞周圍的巨噬細胞對包囊的形成有著重要的影響[2]。

目前旋毛蟲不同時期的排泄分泌物(即ES產(chǎn)物)影響宿主細胞功能的研究相對甚少。另外免疫細胞與成肌細胞共培養(yǎng)是近幾年來建立的一種體外研究免疫生理的新技術(shù)，是研究細胞間相互作用的有力手段。因此，本研究通過分離培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲時期的ES產(chǎn)物，體外研究與旋毛蟲ML ES作用后的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化的影響，利用共培養(yǎng)技術(shù)，建立了巨噬細胞與成肌細胞共培養(yǎng)模型，探討與肌幼蟲排泄分泌物作用的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化的影響，這些研究為深入了解ES產(chǎn)物的功能同時為旋毛蟲入侵后包囊形成機理提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞、實驗動物與旋毛蟲蟲種 小鼠巨噬細胞株J774A.1和小鼠成肌細胞C2C12購自ATCC(American Type Culture Collection)，本室常規(guī)傳代。Wistar大鼠，購自長春生物制品研究所，用于旋毛蟲傳代保種及旋毛蟲不同時期排泄分泌物的收集。中國河南豬旋毛蟲分離株T.spiralis(ISS534)，由本室傳代保種。

1.1.2主要試劑 嵌入小皿和共培養(yǎng)板、25 mL細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(6孔和24孔)購自COSTAR公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液、Hoechst 33342購自Sigma公司；細胞蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG以及羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；正常山羊血清購自鼎國；高糖DMEM培養(yǎng)基、馬血清購自GIBCO公司；鼠抗Myosin Heavy Chain單抗購自Upstate公司；鼠抗Myogenin單抗均自美國Santa Cruz公司；兔抗MyoD多抗均自美國Santa Cruz公司；Alexa Fluor 555-羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488-羊抗鼠IgG購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物(ML ES)的收集 取旋毛蟲ISS534保種的Wistar系大鼠1只，脫頸致死，留胴體和膈肌用人工消化液(10 g/L胃蛋白酶和10 mL/L濃鹽酸)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱里消化2 h后，過篩并采用自然沉淀的方法收集感染性肌幼蟲，低倍顯微鏡檢查并計數(shù)后，經(jīng)口感染W(wǎng)istar系大鼠8 000條/只，共10只。與感染后35 d剖殺收集肌幼蟲，將肌幼蟲洗凈并用含200 U/mL青霉素，200 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后離心，收集的培養(yǎng)液上清作為ML ES備用。

1.2.2小鼠J774A.1巨噬細胞以及成肌細胞C2C12的復(fù)蘇及培養(yǎng) 取出液氮罐中凍存的小鼠J774A.1巨噬細胞以及成肌細胞C2C12，立刻置于37 ℃的恒溫水浴鍋中，迅速晃動，當細胞完全解凍后轉(zhuǎn)入含有DMEM培養(yǎng)液的離心管中，水平離心800 r/min，8 min，棄上清。用含有100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。細胞匯合度達到90%時0.25%胰酶消化繼續(xù)培養(yǎng)，細胞傳代培養(yǎng)2～3次后用于實驗研究。

1.2.3旋毛蟲肌幼蟲期排泄分泌物(ML ES)處理巨噬細胞 將復(fù)蘇培養(yǎng)后的J774A.1巨噬細胞按每孔0.5×105個細胞接種于12 mm嵌入小皿并放入24孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長約20 h后，其中一些嵌入小皿中加含有ML ES(5 μg/mL)的10% DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h，另一些嵌入小皿中加含相同體積PBS的10%DMEM培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.4J774A.1-C2C12共培養(yǎng)模型的建立與分組 將小鼠成肌細胞C2C12按每孔1×105個細胞接種于含有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中(用于細胞免疫熒光分析)或2×105接種于6孔板(用于Western blot分析)，待細胞貼壁后，將其分成3組：標記A(ML ES處理組)、標記B(PBS處理組)、標記C(非共培養(yǎng)組)。方法如下：吸出(A)組的C2C12成肌細胞原生長培養(yǎng)液后，將含有ML ES的J774A.1巨噬細胞嵌入皿小心移入24孔板或6孔板中央，之后在培養(yǎng)板和嵌入小皿之間加入分化培養(yǎng)基；吸出(B)組的C2C12成肌細胞原培養(yǎng)液后，將含有PBS的J774A.1巨噬細胞嵌入小皿小心移入24孔或6孔培養(yǎng)板中央，之后在培養(yǎng)板和嵌入皿之間加入分化培養(yǎng)基；(C)組為單純分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠成肌細胞C2C12(非共培養(yǎng))。各組均按1 d、3 d、6 d 3個時間段標記后，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5細胞免疫熒光法檢測與ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，取對照組和處理組的C2C12細胞，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛固定0.5 h，吸走多聚甲醛，PBS洗滌3次。浸泡在0.1%Triton X-100中，4 ℃通透20 min后PBS洗3次。用封閉液(含5%正常山羊血清)室溫封閉30 min。吸出封閉液，封閉液稀釋以下一抗：兔抗MyoD多克隆抗體(1∶50)、鼠抗Myogenin單克隆抗體(1∶100)、鼠抗肌球蛋白重鏈MHC單克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜。次日用PBS洗3次，每次10 min。滴加Alexa Fluor 555 Goat anti-rabbit IgG或Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG(封閉液1∶200稀釋)，避光孵育30 min。PBS洗3次，每次10 min。Hoechst 33342室溫復(fù)染5 min，PBS洗2次，每次10 min。甘油封片，將細胞板置于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6Western blot分析與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化以及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，收集對照組和實驗組的C2C12細胞，經(jīng)裂解液(用時提前加入PMSF，終濃度為1 mmol/L)獲取細胞總蛋白，采用BCA法對所抽提蛋白質(zhì)的濃度進行測定。獲取細胞總蛋白進行12%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫封閉2 h；封閉液稀釋以下一抗：兔抗MyoD多克隆抗體(1∶100)、鼠抗Myogenin單克隆抗體(1∶500)、鼠抗肌球蛋白重鏈MHC單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日用PBST洗膜3次，每次10 min；瀝干后將轉(zhuǎn)移膜用辣根過氧化酶標記的羊抗鼠或者辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG(封閉液1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；同樣用PBST洗膜3次，每次10 min，隨后用ECL化學(xué)發(fā)光顯示試劑盒顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1細胞免疫熒光法檢測與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 通過細胞免疫熒光分析在共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對小鼠成肌細胞C2C12的MyoD、Myogenin和MHC表達的影響。結(jié)果顯示，與正常分化的對照組相比，MyoD(如圖1)、Myogenin(如圖2)和MHC(如圖3)陽性細胞數(shù)明顯減少。

圖1與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對C2C12成肌細胞MyoD表達的影響

Fig.1Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyoDofC2C12myoblast

2.2Western blot分析與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對成肌細胞分化以及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 Western blot分析進一步檢測了這些因子的表達變化。如圖4所示，ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)組，MyoD、Myogenin以及MHC蛋白的表達明顯低于對照組蛋白的表達。

3 討 論

目前對巨噬細胞與肌細胞的相互作用，已經(jīng)有了深入的研究，但在旋毛蟲感染肌細胞后，巨噬細胞對生肌程序的調(diào)節(jié)國內(nèi)外尚未報道。本實驗室先前的研究已表明巨噬細胞是旋毛蟲免疫調(diào)節(jié)的靶細胞，那么ES產(chǎn)物調(diào)節(jié)的巨噬細胞不但在免疫逃逸中發(fā)揮重要的作用，同時在感染肌細胞表型的改變中同樣發(fā)揮著重要的角色[1-2]。衛(wèi)星細胞的再生與分化完全依靠于其周圍的環(huán)境，詳細的了解旋毛蟲ES產(chǎn)物作用后的巨噬細胞及其因子與成肌細胞的相互作用將有助于我們從整體上理解旋毛蟲感染后肌細胞表型的轉(zhuǎn)化機制，而不是單單的集中在寄生蟲與肌細胞的相互作用。

圖2與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對C2C12成肌細胞Myogenin表達的影響

Fig.2Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyogeninofC2C12myoblast

圖3與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對C2C12成肌細胞MHC表達的影響

Fig.3Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMHCofC2C12myoblast

損傷肌肉的修復(fù)完全依靠于衛(wèi)星細胞，這些細胞位于基底膜，正常情況下是靜止的，當組織受到損傷時這些細胞被激活、增殖、分化、融合成新的肌管[3]。在這個過程中，巨噬細胞及其釋放的因子被認為起到了重要的作用[4]。在肌肉組織的損傷修復(fù)過程中，首先巨噬細胞被經(jīng)典激活，這些經(jīng)典激活的巨噬細胞去清理壞死的肌肉碎片同時釋放促炎性細胞因子如TNF-α和白血病抑制因子(LIF)來促進衛(wèi)星細胞的增殖，而且這些因子可以下調(diào)MyoD和Myogenin的表達，抑制肌細胞的分化[5-6]。

圖4與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細胞共培養(yǎng)對C2C12成肌細胞MyoD，Myogenin與MHC表達的影響

Fig.4Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyoD,MyogeninandMHCinC2C12myoblast

本研究應(yīng)用共培養(yǎng)技術(shù)，成功構(gòu)建了J774A.1巨噬細胞-C2C12成肌細胞共培養(yǎng)模型，在分化條件下，觀察ML ES處理的巨噬細胞在共培養(yǎng)體系中對小鼠成肌細胞C2C12的成肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)和肌球蛋白重鏈(MHC)表達的影響。MyoD作為成肌細胞分化的早期標志物，在分化的早期12 h表達上調(diào)[7]。中晚期Myogenin對成肌細胞的終末分化進行調(diào)節(jié)，在分化期間持續(xù)表達[8]；MHC則為終末分化標記物。細胞免疫熒光以及Western blot結(jié)果表明在分化條件下，與對照組比較，與ML ES處理的巨噬細胞共培養(yǎng)能夠抑制其成肌調(diào)節(jié)因子MyoD、Myogenin和MHC的表達，即在共培養(yǎng)模型中，ML ES產(chǎn)物處理的巨噬細胞抑制了生肌進程。結(jié)論表明，在旋毛蟲入侵后的肌肉組織修復(fù)及保姆細胞的形成過程中，巨噬細胞發(fā)揮了重要且復(fù)雜的角色，且ES產(chǎn)物處理后的巨噬細胞釋放的分化抑制因子對宿主肌肉組織修復(fù)及旋毛蟲包囊形成是非常重要的。

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