周必英，劉美辰，楊鳳嬌

豬囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)又稱囊蟲病(Cysticercosis)，是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的幼蟲囊尾蚴寄生于人或豬等而引起的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，在我國的感染率為0.14%～3.20%。藥物及手術(shù)治療都有其局限性，疫苗防治該病已成為當(dāng)前研究熱點[1-2]。研究表明，豬帶絳蟲六鉤蚴TSO45W-4B和TSOL18基因均具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，是一種理想的疫苗候選抗原[3-6]。雙歧桿菌(Bifidobacteria)是人和哺乳動物的腸道益生菌，也是一種基因工程受體菌。本研究擬在成功構(gòu)建豬帶絳蟲大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基礎(chǔ)上[7]，研究豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因在長雙歧桿菌中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒和菌種 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18由本課題組制備保存[7]；長雙歧桿菌(B.longum)購自美國菌種典藏中心。

1.2主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購自美國Axygen公司；T4DNA連接酶、DNA Marker、BamHI和EcoRI購自日本Takara公司；MRS培養(yǎng)基購自美國Difico公司；兔抗血清由本室制備[8-10],囊蟲病豬血清采集自建的囊蟲病豬感染模型，囊蟲病患者血清由四川省疾病預(yù)防控制中心提供；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。核酸電泳裝置購自北京六一儀器廠；PCR 儀購自美國 MJ-Research公司；厭氧發(fā)生器購自法國梅里埃公司。

1.3重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌 將購自的B.longum凍干粉用無菌水充分溶解后，涂布于MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于4mlMRS液體培養(yǎng)中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至菌體OD600nm值為0.5左右；按1∶25比例接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h；冰浴30 min，4 ℃10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的0.5 mol/L蔗糖清洗2次，再用100 μL 0.5 mol/L蔗糖緩沖液重懸。取100 μL與重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 1 μg混勻，冰浴10～15 min后轉(zhuǎn)移至至1 mm的電擊杯中，電擊參數(shù)設(shè)置為：電壓1.25 KV、場強12.5 KV/cm、電容25 μF、電阻 200 Ω、轉(zhuǎn)化時間5 ms；電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到900 μL MRS液體培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h；將菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h。挑取上述平板中單個菌落至1 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h；將菌液4 ℃10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入250 μL 25%蔗糖溶液重溶菌體沉淀，37 ℃溫浴30 min，期間每隔5 min振蕩1次，使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定。篩選陽性的轉(zhuǎn)化菌株作為表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實驗。

1.4TSO45W-4B-TSOL18融合基因在長雙歧桿菌中的表達(dá) 選取電轉(zhuǎn)化陽性的轉(zhuǎn)化菌，接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)至OD值為0.6左右，取未誘導(dǎo)的菌液作對照，余下分別加入終濃度為0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)48 h。分別將未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)菌液離心收集菌體，重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中。在冰浴中超聲裂解20 min，4 ℃ 6 000 r/min離心15 min，留取誘導(dǎo)上清及誘導(dǎo)沉淀，用12% SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)的重組蛋白。

2 結(jié) 果

2.1B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的酶切鑒定 從具有氨芐青霉素抗性的B.longum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4 944 bp的pGEX-1λT載體片段和789 bp(351 bp+45 bp+393 bp=789 bp)的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。

圖1B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的雙酶切鑒定

Fig.1IdentificationofrestrictionanalysisoftherecombinantplasmidpGEX-TSO45W-4B-TSOL18inB.longum

M: Marker; 1: The recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18; 2: Restriction analysis of the recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 inB.longumwithBamHⅠ andEcoRⅠ.

2.2B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的PCR鑒定以從具有氨芐青霉素抗性的B.longum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18為模板進(jìn)行PCR擴增可得到888 bp的基因片段，除去載體序列99 bp，TSO45W-4B-TSOL18融合基因?qū)嶋H的長度為789 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖2。測序結(jié)果表明，與預(yù)期序列100%匹配，提示重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功轉(zhuǎn)入長雙歧桿菌。

2.3TSO45W-4B-TSOL18融合基因在長雙歧桿菌中的表達(dá) 轉(zhuǎn)化后的菌株菌體濃度達(dá)到OD值0.6左右時，分別經(jīng)0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/L 濃度的IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白大小理論值為54.82 kD。其中GST標(biāo)簽蛋白26.3 kD，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，在誘導(dǎo)48 h后上清中55 kD處無明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，而在沉淀中誘導(dǎo)前后出現(xiàn)了明顯的條帶差異，且大小與理論的分子量54.82 kD相吻合，初步判斷蛋白成功表達(dá)，分布于沉淀中，見圖3。

圖2B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的PCR鑒定

Fig.2IdentificationofPCRoftherecombinantplasmidpGEX-TSO45W-4B-TSOL18inB.longum

M: Marker; 1-7: PCR product of the recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 inB.longum.

圖337℃IPIG誘導(dǎo)48h表達(dá)鑒定

Fig.3IdentificationofexpressionafterinductionwithIPTGat37℃for48h

M: Marker; 1: Supernatant without induction;

2: Supernatant induced with 0.1 mmol/L IPTG for 48 h; 3: Supernatant induced with 0.5 mmol/L IPTG for 48 h; 4: Supernatant induced with 1.0 mmol/L IPTG for 48 h; 5: Precipitation without induction; 6: Precipitation induced with 0.1 mmol/L IPTG for 48 h; 7: Precipitation induced with 0.5 mmol/L IPTG for 48 h; 8: Precipitation induced with 1.0 mmol/L IPTG for 48 h.

2.4Western blot鑒定 分別使用兔抗血清、囊蟲病豬血清、囊蟲病患者血清與重組蛋白雜交，檢測結(jié)果如圖4所示，重溶后的重組蛋白有特異性的結(jié)合，在55 kD處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)帶，說明重組蛋白在長雙歧桿菌中獲得了表達(dá)，且重組蛋白能被兔抗血清、囊蟲病豬血清和囊蟲病患者血清所識別，具有特異的抗原性。

圖4Westernblot鑒定

Fig.4Westernblotidentification

1: Rabbit antiserum of TSO45W-4B; 2: Rabbit antiserum of TSOL18; 3: Rabbit antiserum of TSO45W-4B-TSOL18; 4: Cysticercosis swine serum; 5: Cysticercosis patients serum; 6: Blank control.

3 討 論

豬帶絳蟲疫苗研究已有20多年的歷史，大體上經(jīng)歷了蟲體疫苗、重組蛋白疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、重組酵母疫苗、重組家蠶桿狀病毒疫苗、重組鼠傷寒沙門氏桿菌疫苗這幾個研究階段,涉及到TSO45W-4B、TSOL18、cC1、AgB等重要抗原分子。其中TSO45W-4B和TSOL18與六鉤蚴的入侵密切相關(guān)，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，是理想的疫苗候選抗原[11-12]。由于宿主MHC分子的多樣性和豬帶絳蟲抗原成分的復(fù)雜性，宿主將針對抗原的多個表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使得單一抗原成分誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答效果往往較低，為此，本研究將免疫及保護(hù)效果肯定的兩種抗原TSO45W-4B、TSOL18編碼基因用15個氨基酸的接頭連接，表達(dá)融合蛋白。

雙歧桿菌(Bb)因其具有獨特的安全性和益生的作用，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，以其為宿主菌的基因治療、功能蛋白表達(dá)和疫苗制備等方面的研究受到了國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注，已在細(xì)菌、病毒、腫瘤、寄生蟲等領(lǐng)域迅速開展起來[13-16]，為傳染病、腫瘤和寄生蟲病的免疫預(yù)防和免疫治療帶來了希望。為了將外源DNA有效引入Bb，需構(gòu)建大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體，本研究采用穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT，這種穿梭表達(dá)載體含有Bb復(fù)制起點、大腸桿菌復(fù)制起點、一個多克隆位點和一個氨芐青霉素抗性基因，使外源DNA在大腸桿菌中操作，然后轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，通過自動復(fù)制或同源整合與基因組進(jìn)行基因交換，從而使外源基因在Bb中穩(wěn)定表達(dá)。本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因的基礎(chǔ)上[8-10]，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化B.longum，經(jīng)IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)48 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示插入的外源融合基因TSO45W-4B-TSOL18在B.longum中成功表達(dá)了相對分子質(zhì)量約為55 kDa的TSO45W-4B-TSOL18/GST融合蛋白，除去載體表達(dá)的GST部分約26 kDa，豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因?qū)嶋H表達(dá)的蛋白約為29 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。Western blot顯示，重組融合蛋白能被兔抗TSO45W-4B血清、兔抗TSOL18血清、兔抗TSO45W-4B-TSOL18血清、囊蟲病豬血清和囊蟲病患者血清所識別。表明TSO45W-4B-TSOL18融合基因在雙歧桿菌中也得到了正確表達(dá)，表達(dá)的重組融合蛋白具有特異的抗原性，且兼具有TSO45W-4B與TSOL18兩種單獨蛋白的免疫活性，為豬囊尾蚴病疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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