崔 斌，官 威，尤 平，李石柱

湖北釘螺(Oncomelaniahupensis) 是日本血吸蟲唯一的中間宿主，我國大陸僅有一種，廣泛分布于長江中下游地區(qū)[1-2]。由于其分布廣泛、孳生環(huán)境復(fù)雜以及地理隔離的影響，湖北釘螺不同地理群體發(fā)生了顯著的遺傳分化和變異。近年來，隨著湖北釘螺的群體遺傳學(xué)、景觀生態(tài)學(xué)等深入研究，我國大陸分布的釘螺地理種群主要?jiǎng)澐譃殚L江中下游的湖沼型景觀種群、高山型景觀種群、喀斯特地貌景觀種群和濱海山丘型景觀種群[3]，其中湖北釘螺湖沼型景觀種群主要分布在長江中下游的湖南、湖北、江西、安徽和江蘇等省的湖沼、水網(wǎng)和丘陵等地區(qū)，這一地區(qū)景觀范圍廣，水網(wǎng)密布，植被豐富，且雨量充沛，是遺傳多樣性最為復(fù)雜的一個(gè)種群，甚至同一地區(qū)不同微生境種群已表現(xiàn)出明顯的遺傳分化[4]。

湖北松滋地區(qū)位于湖北省西南部，地形西高東低，從西南海拔500～800 m較高區(qū)的山地向海拔50 m以下的江漢平原湖區(qū)呈四階梯遞降，境內(nèi)河渠縱橫，間有湖泊，其境內(nèi)有螺環(huán)境多樣，主要包括垸內(nèi)溝渠型和山丘型等，且不同類型環(huán)境下釘螺隨生境變化呈現(xiàn)出不同螺殼形態(tài)，這種在小尺度生境湖北釘螺種群中呈現(xiàn)明顯表型差異的現(xiàn)象并不多見。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記是廣泛分布于真核生物基因組中的一類簡單的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，具有多態(tài)性高、重復(fù)性高、呈共顯性表達(dá)、易檢測(cè)和符合孟德爾分離等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析[5-6]。國內(nèi)應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行湖北釘螺遺傳多樣性的研究開展較晚，且僅有少量應(yīng)用微衛(wèi)星錨定進(jìn)行群體遺傳變異研究的報(bào)告[7-9]。本研究應(yīng)用多態(tài)性微衛(wèi)星DNA標(biāo)記位點(diǎn)，分析了湖北釘螺松滋地區(qū)小尺度生境種群遺傳結(jié)構(gòu)，以探討其遺傳分化程度。

1 材料和方法

1.1釘螺樣本來源 湖北釘螺采自松滋市境內(nèi)的4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)10個(gè)生境，采集地分布見表1。每個(gè)采集地釘螺在解剖鏡下觀察并記錄螺殼形態(tài)，所有釘螺經(jīng)室內(nèi)飼養(yǎng)約1周后，用逸蚴法鑒定釘螺是否感染血吸蟲，取陰性釘螺作為實(shí)驗(yàn)材料，75%乙醇浸泡，4 ℃保存待用。

1.2方法

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 目測(cè)釘螺螺殼形態(tài)初步分類后，采用解剖鏡下觀察鑒定并拍照。

1.2.2分子檢測(cè)

1.2.2.1DNA抽提 取單只湖北釘螺的腹足肌肉組織30 mg，采用軟體動(dòng)物DNA小量提取試劑盒(購自美國OMEGA生物技術(shù)公司)提取基因組DNA，-20 ℃保存待用，操作方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.2.2熒光標(biāo)記引物 多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選參照文獻(xiàn)[11-12]，獲得的多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的正向引物進(jìn)行6-FAM、HEX和NED熒光標(biāo)記(均購自上海生工生物技術(shù)有限公司)(表2)。

1.2.2.3PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括20 ng模板DNA、0.5 μmol/L引物、1U的Taq酶、0.15 mmol/L的dNTPs、1.5 mmol/L的MgCl2和1×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，50～55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.2.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 取1 μL PCR產(chǎn)物，0.6 μL ROX標(biāo)準(zhǔn)物和8.4 μL Hi-Di甲酰胺混勻，95 ℃變性5 min，隨后用全自動(dòng)遺傳分析儀檢測(cè)PCR產(chǎn)物(3730XL，USA, ABI )。

表1 湖北釘螺樣本采集地分布

表2 湖北釘螺6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增引物

1.2.3數(shù)據(jù)分析 基因掃描結(jié)果經(jīng)Genescan和Genotype分析軟件獲得擴(kuò)增片段的精確長度，結(jié)果以Excel表格形式輸出，使用MS-Tools的Excel Microsatellite Toolkit轉(zhuǎn)化原始數(shù)據(jù)為FSTAT2.9.3.2可識(shí)別文件，計(jì)算群體內(nèi)的遺傳分化指標(biāo)平均等位基因數(shù)(mean number alleles，MNA)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)和觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)。應(yīng)用POPGENE1.3.2軟件分別檢驗(yàn)哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)、F-statistics固定指數(shù)(包括Fit、Fst和Fis)和遺傳距離。應(yīng)用ARLEQUIN3.11[13]軟件計(jì)算成對(duì)群體間的基因流(Nm)，利用AWOVA模塊分析群體遺傳變異的組成，再用POPGENE1.3.2軟件以非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair Group Method with Arith-metic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析[14]。在GENEPOP中對(duì)遺傳距離與地理距離的相關(guān)性進(jìn)行回歸的Mantel檢驗(yàn)，根據(jù)Botstein等[15]公式計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content，PIC)。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 本研究共調(diào)查了松滋市10個(gè)生態(tài)環(huán)境，獲得湖北釘螺樣本400余只，解剖鏡下鑒別不同生境下的釘螺螺殼形態(tài)可見，螺殼形態(tài)從山丘環(huán)境的光殼逐步向溝渠環(huán)境的淺肋、深肋演變，其中王家橋鎮(zhèn)、陳店鎮(zhèn)4個(gè)山丘環(huán)境采獲的釘螺為光殼，新江口鎮(zhèn)3個(gè)環(huán)境采獲的釘螺同時(shí)存在光殼和肋殼(淺肋和深肋)，老城鎮(zhèn)3個(gè)溝渠環(huán)境為肋殼(圖1)。

圖1本研究中不同采集地湖北釘螺形態(tài)

Fig.1ShelltypesofO.hupensisinthisstudy

From left in line 1: SA, SB, SC, SD, SE; line 2: SF, SG, SH, SI, SK.

2.2基因掃描結(jié)果

2.2.1微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)多態(tài)信息含量 6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在10個(gè)群體中一共檢測(cè)到141個(gè)等位基因，其中B14位點(diǎn)上最多，為34個(gè)，D11和T617位點(diǎn)最少，為20個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到23.5個(gè)。6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)為1.575，各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)并不平衡，且數(shù)值差異較大，范圍從0.445至3.060。

2.2.2群體內(nèi)遺傳變異 10個(gè)群體中，觀測(cè)雜合度較高，在0.59～0.89之間，其中溝渠環(huán)境肋殼釘螺群體觀察雜合度顯著高于山丘型環(huán)境的光殼釘螺群體，最高者為老城鎮(zhèn)鎮(zhèn)SH群體(0.892)，最低者為陳店鎮(zhèn)SC群體(0.430)。各群體基因多態(tài)信息含量較高，PIC在0.528-0.857之間，平均PIC為0.732。其中溝渠環(huán)境肋殼釘螺群體顯著高于山丘型環(huán)境的光殼釘螺群體，最高者為老城鎮(zhèn)鎮(zhèn)SH群體(0.857)，最低者為新江口鎮(zhèn)SF群體(0.528)。各群體內(nèi)近交系數(shù)Fis較低，范圍在0.056-0.638間，平均為0.301，山丘型光殼釘螺群體顯著高于溝渠環(huán)境肋殼釘螺群體。各群體的遺傳變異系數(shù)見表3。

表3 松滋釘螺遺傳變異系數(shù)

2.2.3群體間遺傳差異

2.2.3.1F-統(tǒng)計(jì)量 F-統(tǒng)計(jì)量中3 個(gè)固定指數(shù)群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、群體間基因分化系數(shù)(Fst)和總?cè)后w的近交系數(shù)(Fit)均是反映群體近交程度或群體間遺傳分化的指標(biāo)。本研究F-統(tǒng)計(jì)量結(jié)果見表4，總?cè)后w和群體內(nèi)近交系數(shù)較高，分別為40.35%和30.32%，表明群體內(nèi)近交嚴(yán)重；各亞群體間基因分化系數(shù)(Fst)為14.40%，表明群體間存在一定遺產(chǎn)分化，但分化程度并不平衡，其中SC與SG群體間Fst值最大，為25.25%，SF與SI群體間遺傳分化最小，為-1.56%。群體SE與SK間的基因流最大，為19.78，群體SI和SF間基因流最小，為-16.23。

表4 所有樣本F-statistics固定指數(shù)

表5 遺傳分化程度(FST)(下)和基因流(Nm)(上)

Note: *P<0.05; **P<0.01。群體代號(hào)同表1。Population codes see Table 1.

表6 遺傳距離和地理距離

注: 對(duì)角線右上：地理距離(KM)；對(duì)角線左下；遺傳距離。Diagonal right: geographical distance (KM); diagonal left; genetic distance.

2.2.3.2遺傳距離和地理距離 對(duì)群體間遺傳距離與地理距離的相關(guān)性進(jìn)行回歸的Mantel檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩者間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，(R2=0.248，P<0.05)(圖2)，群體遺傳分布符合距離隔離模型，相關(guān)性為15.75%。

圖2遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性分析

Fig.2Analysisontherelationshipbetweengeneticdistanceandgeographicdistance

分子變異等級(jí)分析的結(jié)果顯示，松滋釘螺的變異主要存在于個(gè)體間，占總變異的86.48%，群體間變異和群體內(nèi)個(gè)體間變異僅占總變異的7.02%和6.51%(表7)。群體的Fst為0.144，Nm為1.4857，顯示群體間遺傳差異小，分化不顯著。

2.3聚類分析 基于10個(gè)群體間的遺傳距離，用非加權(quán)平均法(UPGMA)聚類顯示，肋殼(深肋)釘螺SH、SI、SK與光殼螺SE聚為一支后，再與光殼螺SA、SB形成的分支聚為一支；淺肋殼螺SF、SG先聚一起后，再與光殼SD、SC聚為第二分支。

圖310個(gè)湖北釘螺群體的UPGMA聚類分析

Fig.3UPGMAclusteranalysisoftenO.hupensispopulations

表7 釘螺種群分子變異分析結(jié)果

3 討 論

湖北松滋地區(qū)位于長江中下游地區(qū)，該地處巫山山系荊門分支余脈和武陵山系石門分支余脈向江漢平原延伸的過渡地帶，地勢(shì)西高東低，是山丘型和平原溝渠交界地帶，生態(tài)景觀多樣，不同景觀下湖北釘螺表現(xiàn)為不同的螺殼形態(tài)，即光殼和肋殼(淺肋和深肋)[16]。盡管如此，線粒體基因COI序列分析表明該地不同螺殼形態(tài)的湖北釘螺，并未表現(xiàn)明顯的遺傳差異[17]。由于單個(gè)線粒體基因序列標(biāo)記的局限性和不能對(duì)全基因組遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析[18]，因此，有必要對(duì)該地釘螺的遺傳多樣性進(jìn)行進(jìn)一步深入分析。本研究調(diào)查了山丘型和垸內(nèi)溝渠的10個(gè)地理群體，螺殼形態(tài)分別表現(xiàn)為光殼和肋殼，其中地處2種環(huán)境交界地帶的新江口鎮(zhèn)同時(shí)存在光殼和肋殼釘螺，肋殼則表現(xiàn)為過渡類型的淺肋型。為進(jìn)一步探討這種螺殼形態(tài)演變趨勢(shì)的遺傳本質(zhì)，本研究選擇6個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)對(duì)該地區(qū)10個(gè)湖北釘螺群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討松滋地區(qū)不同螺殼形態(tài)的湖北釘螺群體遺傳分化情況。

本研究6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在10個(gè)群體中共檢測(cè)到141個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到23.5個(gè)，表明各位點(diǎn)在不同群體間多態(tài)性較為明顯，并據(jù)此計(jì)算各群體的多態(tài)信息含量(PIC)。PIC是描述群體在微衛(wèi)星座位上的遺傳變異程度的重要指標(biāo)，PIC 值越大，說明群體內(nèi)基因一致性差，變異越大，選擇潛力也大；反之，PIC 越小，說明群體變異性越小，選擇潛力也小[19]。本研究的10個(gè)群體中，PIC值為肋殼螺群體SH、SI、Sk大于光殼螺群體SA、SB、SC、SD、SE，光殼螺群體大于淺殼螺群體SF、SG，提示地處垸內(nèi)溝渠環(huán)境下的肋殼釘螺群體的遺傳變異較大，光殼釘螺群體遺傳變異次之，而淺肋型釘螺群體遺傳變異最小。盡管如此，10個(gè)群體的期望雜合度均大于0.5，表明該地區(qū)釘螺群體遺傳分化明顯，具有豐富的遺傳多樣性。

利用F統(tǒng)計(jì)量評(píng)估該地區(qū)遺傳多樣性表明，各位點(diǎn)的的FST平均值為0.1440，即14.4%的遺傳變異來自群體間，85.6%的遺傳變異來自群體內(nèi)個(gè)體間，這表明松滋地區(qū)湖北釘螺雖然受到地理環(huán)境影響而分割成一些亞群，但各群體間遺傳分化主要是由于釘螺個(gè)體間的遺傳變異形成，而Fis、Fit值均為正值，且群體近交系數(shù)為30.32%，也表明釘螺群體間基因流不高[20]。AMOVA分析結(jié)果顯示，10地釘螺個(gè)體間遺傳變異(86.48%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于群體間遺傳變異(7.02%)和群體內(nèi)遺傳變異(6.51%)，也說明遺傳變異主要來自群體個(gè)體間，群體間遺傳分化很小，其原因是由于采集點(diǎn)分布于同一水系，遺傳分化并不明顯[20]。因此，盡管在遺傳距離與地理距離表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，但由于本研究為小尺度下景觀群體，因此，群體間遺傳分化指數(shù)相差并不大，這可能是由于10個(gè)景觀環(huán)境距離并不遠(yuǎn)，雖然殼型不同，但是都屬于湖沼型群體的原因。利用UPGMA法聚類樹顯示，肋殼中的淺肋和深肋型釘螺群體各自形成明顯的聚類后，分別與不同的光殼釘螺群體形成聚類，表明光殼釘螺群體中遺傳多樣性更為豐富。

綜上所述，盡管松滋地區(qū)湖北釘螺螺殼形態(tài)表現(xiàn)出多種形態(tài)，但是微衛(wèi)星DNA掃描各釘螺群體顯示，雖然群體內(nèi)遺傳多樣性較高，但遺傳變異主要來自于群體個(gè)體間，各景觀環(huán)境的釘螺群體間遺傳分化不明顯，這與石朝輝等人對(duì)廟河地區(qū)釘螺不同殼型間基因差異[17]、邱持平等對(duì)安徽地區(qū)釘螺不同生態(tài)環(huán)境下CoI基因差異的研究結(jié)果相一致[21]。目前推測(cè)可能是由于不同的生態(tài)環(huán)境的影響，如溫度、濕度、海拔等，造成殼型有所不同。

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