廖茜，易萍，鄭英如，俞麗麗，鐘小林，黃寅虎，韓磊，朱玉娟，李力

傳統(tǒng)獲取胎兒遺傳信息進行的產前診斷技術為有創(chuàng)性操作[1-4]，對胎兒及母體均存在潛在的損傷，以致其臨床推廣及應用受到一定程度的限制[5]。自Lo等[6]發(fā)現(xiàn)母體循環(huán)中存在游離胎兒DNA(cell-free fetal nucleic acids，cffDNA)后，利用孕婦外周血中的cffDNA進行無創(chuàng)產前診斷(noninvasive prenatal diagnosis，NIPD)取得了飛躍性的進展。但胎兒DNA在孕婦血漿總DNA中所占比例甚微，其檢測受到較大限制。點突變檢測是目前DNA分子診斷的主要研究內容，但其技術要求高，尤其是低豐度DNA檢測技術要求更甚，故需探尋一種高靈敏度和高特異性的方法。

我們在前期實驗中以雌激素受體α的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(c.454-397T＞C)、β-地中海貧血常見的2種單核苷酸突變[IVS-Ⅱ-654(C→T)、CD17(A→T)]作為研究對象，利用聚合酶鏈反應(PCR)/連接酶檢測反應(LDR)結合毛細管電泳技術對血漿胎兒DNA實驗模型進行檢測，發(fā)現(xiàn)該技術對低豐度基因突變的檢測靈敏度可達到1:10 000，初步證明其可滿足母體血漿胎兒DNA點突變檢測的要求[7]。但該方法需純化PCR產物，然后將純化的產物用于下一步的LDR反應，純化過程中可能出現(xiàn)污染，影響實驗結果。因此，我們在前期實驗基礎上進行了改良，擬直接將PCR產物應用于LDR檢測，以達到簡化步驟、減少污染的目的。本研究以β-地中海貧血CD17(A→T)突變作為研究對象，探索LDR技術結合毛細管電泳檢測母體血漿中胎兒父系DNA點突變的可行性，以期為胎兒單基因遺傳性疾病的無創(chuàng)產前診斷尋求一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液標本 β-地中海貧血外周血標本：由大坪醫(yī)院檢驗科提供，EDTA抗凝。正常人及正常孕婦外周血標本：經(jīng)本人同意并簽署知情同意書后抽取，EDTA抗凝。

1.1.2 主要試劑及來源 普通寡核苷酸引物、LDR寡核苷酸引物由大連寶生物(TaKaRa)公司合成；熒光定量PCR相關引物及探針由上海生工合成；PCR試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA連接酶購自美國NEB公司；全血基因組DNA提取試劑盒購于Qiagen公司。

1.2 全血DNA提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA，操作步驟按說明書進行，置－20℃冰箱內備用。PCR引物：上游5'-ACTAGCAACCTCAAACAGACACCA-3'，下游5'-TCAGTGCCTATCAGAAACCCAAG-3'[7]。

1.3 PCR擴增及產物電泳 擴增體系包括PCR master mix 25μl，正、反向引物(10μmol/μl)各2μl，突變型外周血DNA 20pg，正常人外周血DNA(分別為100、50、10、1ng)，ddH2O補足至50μl；另設陰性對照組，只加入正常人外周血DNA。反應條件：95℃ 5min；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s，循環(huán)45次；72℃ 5min。PCR擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120V，30min)，凝膠成像掃描系統(tǒng)下觀察結果并進行圖像分析。

1.4 LDR反應 LDR上游引物序列為5'-GCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3'，5'端6-FAM標記；下游引物序列為5'-AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGT GGTG-3'，5'端磷酸化修飾、3'端C3標記[7]。PCR產物置于95℃環(huán)境中15min，緩慢冷卻至4℃?zhèn)溆?。反應體系為：10×Buffer 2μl，LDR上、下游引物(5μmol)各0.1μl，DNA連接酶8U，PCR產物5μl，ddH2O補足至20μl。95℃變性2min；94℃ 30s、65℃ 1min，循環(huán)20次；95℃ 10min。連接產物由重慶醫(yī)科大學感染分子生物中心進行檢測。(1)純化：①取8μl LDR產物加入PCR管中，加入1μl 3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和1μl 0.125mol/L EDTA，混勻后，加入20μl無水乙醇混勻，室溫放置15min；②3000g離心30min，倒置PCR管，去除上清；③加入30μl 70%乙醇，輕微震蕩后，1600g離心15min，倒置PCR管，去除上清；④重復步驟③；⑤在真空濃縮儀中，干燥沉淀。(2)變性：加入10μl Hi-Di甲酰胺和0.1μl GeneScanTM-500Liz?分子量內標，95℃孵育5min，冰上放置5min。(3)上機：對PCR板相應位置的樣品進行編號，在室溫下，于POP-6膠(ABI)、1×電泳緩沖液(ABI)中電泳，應用CEQ8000型遺傳分析儀，ABI片段分析軟件GeneMapper V3.5對結果進行分析。

1.5 孕婦血漿胎兒基因的檢測 血漿制備：采孕婦新鮮外周血5ml，EDTA-K2抗凝，1600g離心10min，取上清，16 000g再次離心10min，取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｑ獫{DNA的提?。翰捎肣IAamp Blood DNA midi kit提取孕婦血漿DNA，60μl洗脫液溶解過濾，將回收液再次加入吸附柱中過濾，最終所得DNA －20℃保存?zhèn)溆?。限制性酶切：?5μl DNA加20U限制性內切酶Hinp1 Ⅰ和20U Hha Ⅰ (NEB，USA)，37℃水浴16h，65℃水浴20min。實時定量PCR：以RASSF1A為靶點檢測胎兒基因，擴增體系為緩沖液(含Mg2+)5μl，dNTP 4μl，TaqMan探針100μmol，Hot Start Version Taq(TaKaRa)300μmol，上、下游引物(10μmol)各1.4μl，酶切后DNA 20μl，ddH2O補足至50μl，離心混勻。50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s、62℃ 30s、72℃30s，循環(huán)50次。以β-actin基因作為內參照[8]。

1.6 孕婦血漿模型的建立及檢測 正常孕婦血漿DNA中加入20pg CD17(A→T)突變雜合子外周血DNA后進行擴增，擴增產物電泳及LDR方法同前所述，以正常孕婦血漿DNA作為陰性對照。

2 結 果

2.1 測序結果 利用AB片段反向引物測序，CD17(A→T)突變的AB片段測序結果顯示，第35位堿基(方框內)處有2個峰(T峰、A峰)，說明此處為CD17(A→T)突變的雜合子(圖1A)。利用CD片段反向引物測序，無CD17(A→T)突變的正常CD片段的測序結果顯示，第41位堿基(方框內)處只有一個峰(A峰)，無G峰，說明此處無CD17(A→T)突變(圖1B)。

圖1 CD17(A→T)突變的AB片段及正常AB片段測序結果(反向引物測序)Fig.1 Sequencing of CD17 (A→T) mutation of AB fragment (A) and normal AB fragment (B) (reverse primer sequence)

2.2 LDR檢測 以含有CD17(A→T)突變的PCR擴增產物作為LDR模板，采用8U DNA連接酶進行連接反應，采用CEQ8000型遺傳分析儀分析LDR產物。結果顯示，LDR檢測靈敏度可達1:5000，產物峰的面積隨著正常人外周血DNA濃度的增加而減少，至1:10 000處不能與雜峰區(qū)分，且無CD17(A→T)突變擴增產物的陰性對照未檢測到LDR產物(圖2)。

2.3 孕婦血漿胎兒基因檢測 將酶切前后的孕婦血漿DNA進行實時定量PCR檢測(圖3)，可見RASSF1A基因酶切前Ct值為30.33，酶切后Ct值為32.61，以β-actin基因作為對照，其酶切前Ct值為30.33，酶切后未檢測出熒光。高甲基化RASSF1A可代表胎兒游離DNA，せ SSF1A基因可作為陽性質控。

2.4 孕婦血漿模型LDR產物檢測結果 正常孕婦血漿DNA中加入20pg CD17(A→T)突變雜合子外周血DNA擴增產物，LDR產物峰可明顯與雜峰區(qū)分(圖4)。

圖2 LDR產物分析圖Fig.2 Analysis of LDR productsA-D represent the LDR products with the different concentrations of normal peripheral blood DNA mixed with 20pg CD 17 (A→T) mutant hybrid DNA as template for PCR amplification, corresponding sensitivities are 1:100, 1:1000, 1:5000, 1:10000; E and F show the negative control.They are the electrophoresis results by genetic analyzer CEQ8000, abscissa indicates the length of fragment, ordinate indicates the intensity of fluorescence, arrows show connection product

3 討 論

Lo等[5]研究表明，母體血漿中胎兒DNA濃度占血漿總DNA濃度的0.4%～11.9%，檢測過程中母體等位DNA片段可干擾胎兒DNA片段的檢測，增加胎兒基因突變檢測的難度及誤診機會[9]。近幾年比較熱門的無創(chuàng)產前診斷檢測技術包括大規(guī)模平行基因組測序、應用鳥槍測序法通過計算父母的單倍體基因來測量胎兒的基因組[10]等，但上述方法往往因成本高、操作復雜、周期長、對外周血樣本要求高等問題而難以廣泛開展。近期還有研究使用高分辨熔解分析(HRM)方法，用于父源性已知基因點突變的檢測，但其在妊娠早期不能完全與母體血漿DNA區(qū)分[11]。此外，反向斑點雜交也是目前的一種有效方法，可用于臨床檢測β-地中海貧血的基因突變，但對于β-地中海貧血的點突變仍有一定誤診率。有研究證明，單基因突變位點周圍的單核苷酸多態(tài)性位點可直接影響檢測結果的準確性，故應根據(jù)多態(tài)性位點設計特異性的寡核苷酸探針[12]。

圖3 孕婦血漿DNA酶切前后的實時熒光定量分析曲線圖Fig.3 Real-time fluorescence quantitative analysis curves of pregnant women plasma DNA before and after enzyme digestion2, 3 represent the RASSF1A gene in real-time fluorescence quantitative analysis before and after enzyme digestion. 1, 4 represent the β-actin gene in real-time fluorescence quantitative analysis before and after enzyme digestion

圖4 孕婦血漿模型LDR產物檢測分析圖Fig.4 LDR products of pregnant women plasma modelA represent the LDR product which is the normal maternal plasma DNA mixed with 20pg CD 17 (A→T) heterozygous mutant DNA PCR amplification product as a template; B is a negative control. It is the electrophoresis results by genetic analyzer CEQ8000; Abscissa indicates the length of fragment, ordinate indicates fl uorescence intensity

本研究將PCR和LDR技術相結合，建立了一種可針對孕婦外周血DNA中的父源性β-地中海貧血單基因點突變進行檢測的方法。將低濃度突變型外周血基因組DNA混入不同濃度梯度的正常人外周血基因組DNA，擴增后進行LDR反應，采用CEQ8000型遺傳分析儀進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)PCR/LDR結合毛細管電泳技術可檢測出50ng正?；蚪MDNA中含有的20pg β-地中海貧血CD17(C→T)雜合突變LDR產物，且產物峰面積隨著正常模板濃度增加而降低，其基因突變檢測的靈敏度可達1:5000。因此，將PCR產物直接用于LDR檢測的靈敏度完全能夠滿足孕婦血漿中胎兒DNA的檢測，從而可以簡化步驟，減少純化過程中導致污染的機會。而2006年發(fā)現(xiàn)的位于3號染色體的RASSF1A基因在胎兒DNA中表現(xiàn)為高甲基化，在母血細胞表現(xiàn)為低甲基化，通過這種不同甲基化形式的差異可檢測出孕婦外周血漿DNA中的胎兒源性DNA[7,13]。故用甲基化敏感的限制性內切酶Hinp1 Ⅰ和Hha Ⅰ切掉非甲基化的母源性DNA，余下的即為胎兒源性DNA，將其作為下一步臨床病例驗證的陽性質控可降低假陰性率。在正常孕婦外周血血漿DNA中加入20pg β-地中海貧血CD17(C→T)雜合突變擴增產物，采用本研究建立的方法，LDR產物峰可明顯與雜峰區(qū)分。

綜上所述，PCR/LDR/毛細管電泳技術用于檢測低豐度基因點突變具有很高的靈敏度，有望用于母體血漿中胎兒DNA點突變的檢測，且該方法與目前常用的無創(chuàng)產前診斷技術相比具有操作簡便、價格低廉、僅需一個工作日即可完成等優(yōu)勢。該方法理論上也可用于其他單基因點突變疾病的檢測，但尚有待臨床驗證。

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