王 偉， 趙翡翠， 陳 良， 聶繼紅*

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000)

白喉烏頭為毛茛科植物白喉烏頭AconitumleucostomumWorosch的干燥根，主產(chǎn)于我國(guó)新疆地區(qū)，在治療風(fēng)濕類疾病方面有獨(dú)特療效[1]。據(jù)報(bào)道[2-3]，白喉烏頭中含有氫溴酸高烏甲素、喉烏堿及去乙酰刺烏頭堿等，其中高烏甲素氫溴酸鹽在我國(guó)作為非成癮性鎮(zhèn)痛藥生產(chǎn)，而其在白喉烏頭中含有量很高，約占總生物堿量的40%，但未見有采用HPLC法測(cè)定白喉烏頭藥材中氫溴酸高烏甲素量的相關(guān)報(bào)道，同時(shí)白喉烏頭為烏頭屬植物，應(yīng)含有烏頭屬植物常見的雙酯型生物堿，其可能是白喉烏頭中的藥效成分和毒性成分[4]，有必要對(duì)白喉烏頭中生物堿成分和含有量進(jìn)行研究分析。因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿，為白喉烏頭植物資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Direct-QTM5超純水儀(Millipore公司)，SK3300LH超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，SI-234電子天平(北京丹佛儀器有限公司)，AG-135電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，XBridge-C18色譜柱。

1.2 試藥 白喉烏頭樣品(2013年采自新疆尼勒克地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部李永和主任中藥師鑒定為毛茛科植物白喉烏頭AconitumleucostomumWorosch的干燥塊根)；高烏甲素對(duì)照品(北京世紀(jì)奧科生技術(shù)有限公司，批號(hào)97792-45-5)；烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-13012802)；新烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-13012207)；氨水(分析純)；乙腈(色譜純)；無水乙醇(分析純)；鹽酸(分析純)；三氯甲烷(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridgeTM-C18生物堿專用色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為 乙腈(B)-0.05%冰醋酸(三乙胺調(diào)pH為7.25)(D)梯度洗脫(洗脫程序見表1)；檢測(cè)波長(zhǎng) 235 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果對(duì)照品和供試品色譜圖呈現(xiàn)良好的分離度，見圖1。

A．樣品 B．對(duì)照品1．氫溴酸高烏甲素 2．新烏頭堿 3．烏頭堿A．sample B．reference substance；1．hydrobromide lappaconitine 2．mesaconitine 3．a(chǎn)conitine

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿適量對(duì)照品并精密稱定,用色譜純乙腈定容配制成質(zhì)量濃度分別為4.075 mg/mL、2 mg/mL、2.05 mg/mL的混合對(duì)照品溶液,再依次梯度配制成6種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液備用(見表2)。

表2 混合對(duì)照品質(zhì)量濃度

2.3 供試品溶液的制備 取白喉烏頭樣品粉末(過六號(hào)篩)約5 g并精密稱定，加入氨試液5 mL密閉浸潤(rùn)后加入50 mL無水乙醇稱定質(zhì)量，超聲(23 ℃,53 kHZ)提取20 min后再次稱定質(zhì)量并用無水乙醇補(bǔ)足，過濾，濾液60 ℃以下?lián)]干；殘?jiān)?0 mL1%HCl調(diào)pH 2左右,再加入氨水調(diào)pH 11左右，然后用三氯甲烷萃取3次(每次10 mL)，合并三氯甲烷層并60 ℃以下?lián)]干，殘?jiān)右译娑ㄈ葜? mL量瓶，微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積值，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得氫溴酸高烏甲素回歸方程y=8 271 176.586 3x-91 106.980 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2；烏頭堿回歸方程y=11 388 026.846 3x-409 124.842 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1；新烏頭堿回歸方程y=12 205 378.669 9x-83 826.586 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。表明氫溴酸高烏甲素進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.081 5～8.150 0 mg/mL、烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.040 0～4.000 0 mg/mL、新烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.041 0～4.100 0 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算3種化合物的含有量的RSD分別為2.24%、1.56%、2.25%，結(jié)果顯示儀器精密度較高。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取白喉烏頭藥材6份 按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿的峰面積，計(jì)算氫溴酸高烏甲素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.753 5 mg/g， RSD為2.06%(n=6)；烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.068 6 mg/g，RSD為1.16%(n=6)； 新烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.371 3 mg/g，RSD為2.57%(n=6)，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一白喉烏頭藥材約5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、14、20、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為 2.77%、1.61%、2.08%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取白喉烏頭藥材粉末約5 g精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制成供試品溶液，分別加入3種不同質(zhì)量濃度的氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿混合對(duì)照品，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定.計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3～5。

表3 氫溴酸高烏甲素加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.4.6 樣品測(cè)定 取白喉烏頭藥材3份(5.002 0 g、5.003 8 g、5.002 3 g)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定3次，根據(jù)色譜峰面積計(jì)算出白喉烏頭藥材中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿的量，結(jié)果見表6。

表4 烏頭堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表5 新烏頭堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表6 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本研究采用高效液相色譜法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定了白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿和新烏頭堿的量，但氫溴酸高烏甲素作為一種二萜類生物堿非常不穩(wěn)定，對(duì)光和高溫都較敏感，本實(shí)驗(yàn)在供試品前處理過程中采取避光、60 ℃以下?lián)]干等方法，防止其降解。

本實(shí)驗(yàn)在供試品前處理提取溶劑的選擇過程中，參照文獻(xiàn)[5-9]方法，分別篩選了甲醇、乙醇(75%,85%,95%,無水乙醇)、鹽酸(1%,0.5%)、水、氨水乙醚液(75%,85%,95%)、氨水、三氯甲烷等不同溶劑，最后根據(jù)色譜圖的分離度和峰形，最終選擇無水乙醇作為提取溶劑；同時(shí)考察供試品的提取方式(索式提取、連續(xù)回流提取、超聲提取等)，最終選擇超聲提取20 min為供試品提取方法。

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器多波長(zhǎng)掃描，當(dāng)波長(zhǎng)為235 nm時(shí)高烏甲素和烏頭堿、新烏頭堿均能被檢出并且吸收較好，故確定其為檢測(cè)波長(zhǎng)；同時(shí)考慮到白喉烏頭中活性成分的極性差異[10]，因此針對(duì)梯度洗脫系統(tǒng)做了大量的考察和對(duì)比，包括甲醇-水，乙腈-水，甲醇-三氯甲烷-水，乙腈-乙酸氨等系統(tǒng)，經(jīng)比較和分析不同洗脫系統(tǒng)下的色譜圖分離度和峰形，表明乙腈-乙酸氨系統(tǒng)分離效果較好，故確定其為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫，并對(duì)流動(dòng)相的比例做了大量工作，確定在流動(dòng)相中加入二乙胺可以改善色譜峰拖尾現(xiàn)象[11]。

本實(shí)驗(yàn)中高效液相色譜圖中各成分色譜峰清晰，分離度較好，穩(wěn)定性和精密度等方法學(xué)考察均符合要求，表明采用高效液相色譜法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定了白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿和新烏頭堿的量，方法可行，操作簡(jiǎn)便，可用于白喉烏頭中活性成分的測(cè)定和質(zhì)量控制，也為白喉烏頭的資源利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂奠定了基礎(chǔ)。

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