朱彩霞， 王 超， 金麗華*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000)

綿頭雪兔子SaussurealanicepsHand.-Mazz. 為菊科風(fēng)毛菊屬植物，又名綿頭雪蓮花、麥朵剛拉(西藏)，具有解毒除濕之功效，用于治療風(fēng)濕痹癥、通經(jīng)、癲癇等[1]。近年來，國內(nèi)外有研究資料表明，綿頭雪兔子具有消炎止痛，抗氧化，清除自由基等作用[2-4]。

腸道黏膜除了具有消化吸收功能外，還能夠保護(hù)宿主免受病原微生物的入侵，是菌群與宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)者。當(dāng)果蠅腸道受到外界環(huán)境刺激時(shí)，其腸道上皮細(xì)胞會對內(nèi)部和外部因子做出應(yīng)答，以維持其腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。果蠅是研究昆蟲和人類腸道免疫的重要模式生物，利用果蠅研究中草藥對腸道免疫的作用，可以較快而深入地了解中草藥的功效。

本實(shí)驗(yàn)利用多種病原微生物、炎癥離子和金屬離子等刺激因子喂食果蠅，通過果蠅生存率的變化、腸道上皮細(xì)胞及形態(tài)學(xué)變化來分析綿頭雪兔子提取物對果蠅腸道免疫功能的影響，以期為綿頭雪兔子在免疫功能方面的研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 綿頭雪兔子來自西藏那曲地區(qū)，依據(jù)《西藏植物志》[5]鑒定。 NaCl和SDS購自Amresco；KAl(SO4)2購自Sigma公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；其他試劑均為分析純。

1.2 果蠅與菌種 野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) W1118為實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)溫度 (25±1) ℃、相對濕度60%～70%。白僵菌(Beauveriabassiana)為實(shí)驗(yàn)室保存；綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)單虎教授提供。

1.3 儀器 5417R型低溫離心機(jī) (德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器 (美國Scientific Industries)；UV-1800型紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)；SZ51型顯微鏡 (日本Olympus公司)；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡 (德國Zeiss公司)。

2 方法

2.1 綿頭雪兔子提取液的制備 取綿頭雪兔子20 g，剪碎，加入400 mL去離子水浸泡24 h，加熱微沸3 h，過濾，再加入400 mL去離子水用同樣的方法提取2次，合并3次提取的濾液并加熱濃縮至200 mL，即得到質(zhì)量濃度為0.1 g/mL (10%) 的綿頭雪兔子提取液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的配制 對照組的培養(yǎng)基配制方法參見文獻(xiàn)[6]。其中實(shí)驗(yàn)組中加入與對照組去離子水等體積的綿頭雪兔子提取液，實(shí)驗(yàn)組中綿頭雪兔子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.5%和5%。

2.3 菌液的配制

2.3.1 細(xì)菌菌液的配制 綠膿桿菌(LB培養(yǎng)基，37 ℃) 接種到200 mL液體培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液4 000 r/min、25 ℃，離心10 min，棄上清，在沉淀中加入5%蔗糖溶液或含5%蔗糖的綿頭雪兔子提取液。

2.3.2 白僵菌孢子液的制備 將白僵菌在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d (25 ℃)，待其產(chǎn)孢后，刮取孢子加入到PBS中，充分振蕩均勻，過濾，測定A600值，配制成A600值為40的孢子液 (含5%蔗糖)。

2.4 果蠅生存率 分別隨機(jī)收集對照組和實(shí)驗(yàn)組羽化了3 ～ 5 d的果蠅，每組中雌雄果蠅各15只。對各組果蠅饑餓處理2 h后轉(zhuǎn)移到放有5層濾紙的果蠅管中，分別加入致炎因子、細(xì)菌和孢子液等使濾紙充分潤濕。每24 h更換1次濾紙并記錄果蠅死亡數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 免疫染色 分別隨機(jī)收集對照組和實(shí)驗(yàn)組羽化了3 ～ 5 d的雌果蠅，連續(xù)處理NaCl 5 d或SDS 4 d，顯微鏡下提取8～10條果蠅腸道于PBS中，7-AAD染色30 min，多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 腸道形態(tài)變化觀察 收集羽化了3～5 d的雌果蠅，SDS處理后，顯微鏡下提取8～10條果蠅腸道于PBS中，顯微鏡下觀察并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 病原微生物對果蠅生存率的影響 真菌白僵菌的孢子感染6 d后，對照組果蠅的生存率降到15.8%，而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實(shí)驗(yàn)組分別為26.7%和66.7%，與對照組相比分別提高了10.9%和50.9% (P<0.01) (圖1A)。被革蘭氏陰性菌綠膿桿菌感染時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組的生存率相似 (圖1B)。這表明綿頭雪兔子提取物可抵御真菌的感染，且隨著濃度的增加抵御能力增強(qiáng)。

3.2 致炎離子和金屬離子對果蠅生存率的影響 成體果蠅NaCl處理6 d后，對照組的生存率僅為7.6%，而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實(shí)驗(yàn)組分別為63.3%P<0.01 和53.3%P<0.02，提高了7.3倍和6倍 (圖2A)。SDS處理后，喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實(shí)驗(yàn)組生存率分別為45.6% (P< 0.1) 和75.6% (P< 0.01)，是對照組(14.0%) 的3.2倍和5.4倍，并且5%綿頭雪兔子效果更為顯著 (圖2B)。另外，KAl(SO4)2處理果蠅6 d后，喂食5%綿頭雪兔子可顯著提高果蠅的生存率(P< 0.001)，其生存率88.9%是對照組41.1%的2.2倍，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實(shí)驗(yàn)組 (38.9%) 和對照組相似 (圖2C)。此結(jié)果說明綿頭雪兔子提取物可緩解致炎離子和金屬離子引起的損傷，顯著地提高了果蠅的生存率。

圖1 綿頭雪兔子提取物對病原體感染后果蠅生存率的影響

圖2 綿頭雪兔子提取物對致炎離子及金屬離子處理后果蠅生存率的影響

3.3 分析果蠅腸道上皮細(xì)胞 為了進(jìn)一步驗(yàn)證NaCl和SDS處理后綿頭雪兔子提取物對果蠅生存率的影響，本實(shí)驗(yàn)利用7-AAD染色分析了腸道上皮細(xì)胞的死亡情況。結(jié)果表明，不管是NaCl還是SDS刺激，對照組的腸道上皮細(xì)胞均出現(xiàn)大量死亡，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實(shí)驗(yàn)組中腸道上皮細(xì)胞的死亡數(shù)量明顯減少，結(jié)果見圖3。

圖3 綿頭雪兔子提取物對NaCl(A)和SDS(B)處理后果蠅腸道上皮細(xì)胞的影響

3.4 分析果蠅腸道形態(tài)變化 對照組和實(shí)驗(yàn)組SDS (0.6%)處理后分析果蠅的腸道形態(tài)變化。首先，SDS處理4 d后分離腸道，比較腸道的長度。結(jié)果表明，SDS處理的對照組與只喂食蔗糖的果蠅腸道相比，長度明顯縮短，而且在中腸和后腸連接處出現(xiàn)了明顯的黑色素瘤。當(dāng)喂食2.5%綿頭雪兔子時(shí)，與對照組相比腸道長度明顯增加，而且沒有發(fā)現(xiàn)黑色素瘤，但是比只喂食蔗糖的果蠅腸道短一部分 (圖4A)。其次，分析了SDS不同處理時(shí)間對果蠅腸道壁厚度的影響。隨著處理時(shí)間的增加，對照組果蠅的腸道壁厚度逐漸變薄。而喂食2.5%綿頭雪兔子的果蠅腸道壁厚度沒有明顯變化，SDS處理后的第4天和第6天，果蠅腸道壁厚度基本相似 (圖4B)。這表明綿頭雪兔子提取物可保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受SDS誘導(dǎo)的炎癥損傷。

圖4 綿頭雪兔子提取物對SDS處理后果蠅腸道形態(tài)(A)和腸道壁厚度(B)的影響

4 討論

綿頭雪兔子含有芹菜素、紫丁香苷、β-谷甾醇、傘形花內(nèi)酯、雪蓮內(nèi)酯等物質(zhì)[7]。其中，芹菜素具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤和抗炎等作用[8-9]；紫丁香苷具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化以及抗抑郁等作用[10-11]；β-谷甾醇是一種良好的抗氧化劑，具有很好的清除自由基的能力[12]。

腸道是人體內(nèi)最大的免疫器官。果蠅與人類的腸道具有相似的結(jié)構(gòu)和功能；腸道干細(xì)胞的分化機(jī)制也十分相似；同時(shí)癌基因與腫瘤基因在果蠅與人類之間也是高度保守的。所以，可以利用模式生物果蠅研究調(diào)控腸道免疫相關(guān)的中藥及其復(fù)方。為了探討綿頭雪兔子對果蠅腸道免疫的影響，即其抵御病原微生物感染和抗炎的能力，本研究建立果蠅腸道免疫功能損傷模型，通過統(tǒng)計(jì)生存率、分析腸道上皮細(xì)胞死亡和觀察腸道形態(tài)變化等來探討綿頭雪兔子的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示，綿頭雪兔子可抵御真菌白僵菌的感染，而對細(xì)菌綠膿桿菌的感染沒有保護(hù)作用。另外，綿頭雪兔子可緩解NaCl和SDS引起的炎癥反應(yīng)，這可能是由于綿頭雪兔子保護(hù)了腸道上皮細(xì)胞免受炎癥的損傷，從而提高了腸黏膜的免疫功能。對于金屬離子誘導(dǎo)的損傷，5%綿頭雪兔子可提高KAl(SO4)2處理后果蠅的生存率，這可能是綿頭雪兔子減弱了KAl(SO4)2引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[13]。只喂食5%蔗糖和綿頭雪兔子提取物時(shí)果蠅6 d內(nèi)的生存率沒有發(fā)生變化，而且果蠅在2.5%和5%的綿頭雪兔子培養(yǎng)基里的生長狀態(tài)與正常培養(yǎng)基相同，這說明蔗糖和綿頭雪兔子提取物對果蠅不會造成損傷。綜上所述，綿頭雪兔子可提高果蠅的腸道免疫功能，緩解病原微生物和炎癥因子引起的損傷，此結(jié)果為綿頭雪兔子的開發(fā)與利用提供了新思路。

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