張?zhí)斓さ?/p>

[摘要] 目的 了解川南地區(qū)漢族人群D1S80位點(diǎn)群體遺傳多態(tài)性。方法 采用PCR結(jié)合聚丙烯酰胺PAGE電泳及高靈敏度銀染技術(shù)，即Amp-FLP方法對川南地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個體D1S80位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果 在所調(diào)查的120名無關(guān)個體樣本中，觀察到D1S80基因座有18個等位基因，基因頻率分布在0.004166667～0.1958333333之間，雜合度為0.7869，個體識別力為0.87，非父排除率為0.8152，其基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡法則。結(jié)論 D1S80基因座的PCR分型具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度，為法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因鏈鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了川南地區(qū)有用的遺傳信息。

[關(guān)鍵詞] D1S80位點(diǎn)；VNTR；遺傳多態(tài)性；川南地區(qū)

[中圖分類號] Q786 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）01-09-03

人類基因組中存在許多具有高度多態(tài)性的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VNTR）。D1S80是以16bp為重復(fù)單元的VNTR位點(diǎn)，是進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因鏈鎖分析等研究的良好遺傳標(biāo)記之一[1-3]。D1S80位點(diǎn)的遺傳信息雖然在我國漢族其他地區(qū)已有報道[3-5]，但是川南地區(qū)漢族人群D1S80位點(diǎn)群體遺傳資料并不清楚?，F(xiàn)應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp-Flp），即PCR結(jié)合高分辨PAGE電泳及高靈敏度銀染技術(shù)[1]，首次對四川南部地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個體D1S80

1 材料與方法

1.1 樣本收集與DNA提取

收集川南瀘州地區(qū)漢族無關(guān)個體外周血樣本120名樣本，均于2012年6月～2013年3月在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科收集，EDTA抗凝，用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA[6-7]。紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280值，并確定樣本濃度及純度[7-8]。

1.2 主要儀器及試劑

基因擴(kuò)增儀（德國EPP224-Eppendorf 5331型），電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD Powerpac Basic），凝膠圖像成像儀（美國BIO-RAD），蛋白酶K，2×Taq master mix，dNTP，丙烯酰胺。擴(kuò)增D1S80位點(diǎn)的引物序列為（DS80R： 5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3，D1S80L： 5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3）。

1.3 PCR擴(kuò)增

用20μL體系，含DNA樣本3.5μL約10ng，2μL引物，10μL的2×Taq master mix，4.5μL的ddH2O。擴(kuò)增條件為：先95℃預(yù)變性1min 30s，再94℃變性40s，65℃退火30s，72℃延伸40s，共完成35個循環(huán)，然后72℃延伸5min，最后置4℃保溫。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

先用1.5%的瓊脂糖凝膠水平電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)條帶亮度決定下一步的垂直聚丙烯酰胺電泳中所加入的樣本量。然后，用凝膠板大小160mm×200mm×0.75mm，凝膠濃度5%，作垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳緩沖液1×TAE，150V恒壓電泳70～90min，銀染顯帶。銀染結(jié)果在凝膠圖像成像儀（BIO-RAD）上分析并照相。并將D1S80位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，建立分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

基因頻率按照直接計(jì)數(shù)法測定，用x2檢驗(yàn)比較基因型分布資料的觀察值及理論值，判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡，雜合度（H），個體識別力（DP）的計(jì)算參照《法醫(yī)物證學(xué)》[9]，非父排除率（PE）的計(jì)算參照文獻(xiàn)[10]的方法計(jì)算。

2 結(jié)果

我們收集川南瀘州地區(qū)漢族無關(guān)個體外周血樣本120名，用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA，用紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280值，發(fā)現(xiàn)樣本DNA濃度及純度好。然后對這些無血緣關(guān)系個體完成了D1S80基因座多態(tài)性PCR和PAGE電泳分析。代表性電泳結(jié)果如下圖1所示（圖1）。

M：DNA分子量標(biāo)記DL600（顯示400和500bp片段）；

下標(biāo)26/31為一無關(guān)個體的兩個等位基因的分型大小，其他個體的等位基因分型亦在下標(biāo)中注明

在所調(diào)查的120名瀘州地區(qū)漢族無親緣關(guān)系個體樣本中，共觀測到D1S80基因座有18個等位基因，基因頻率分布在0.004166667～0.1958333333之間（表1），其頻率以D1S80*23（0.195833333）最高。雜合度為0.7869，個體識別力為0.87，非父排除率PE為0.8152。

3 討論

隨著遺傳學(xué)研究的不斷深入和人類基因組計(jì)劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在大量具有高度多態(tài)性的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列[1-3]。其中D1S80是以16bp為重復(fù)單元的VNTR位點(diǎn)，定位于染色體1p，其核心序列為GNNGACCACCGGNAAG。對這些可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）多態(tài)性分析是非常必要的。從我們對川南地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個體D1S80基因座多態(tài)性進(jìn)行的研究表明，該位點(diǎn)的PCR分型具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度（圖1）。在所調(diào)查的120名瀘州地區(qū)漢族無親緣關(guān)系個體樣本中，共觀測到D1S80基因座有18個等位基因，基因頻率分布在0.004166667～0.1958333333之間，其頻率以D1S80*23（0.195833333）最高。雜合度為0.7869，個體識別力為0.87，非父排除率PE為0.8152。endprint

雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中，進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2，4-5，11-15]，但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里，我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個體，對D1S80基因座的分析結(jié)果表明，該基因座多態(tài)信息含量大，雜合度、個人識別力高，排除非父的幾率高，有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息，豐富了D1S80多態(tài)性信息，是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

[參考文獻(xiàn)]

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雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中，進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2，4-5，11-15]，但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里，我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個體，對D1S80基因座的分析結(jié)果表明，該基因座多態(tài)信息含量大，雜合度、個人識別力高，排除非父的幾率高，有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息，豐富了D1S80多態(tài)性信息，是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

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雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中，進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2，4-5，11-15]，但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里，我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個體，對D1S80基因座的分析結(jié)果表明，該基因座多態(tài)信息含量大，雜合度、個人識別力高，排除非父的幾率高，有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息，豐富了D1S80多態(tài)性信息，是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

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