陳 聰，喻 嶸*，吳勇軍

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在糖尿病常見慢性并發(fā)癥中的作用研究

陳 聰，喻 嶸*，吳勇軍

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上主要的分子伴侶蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性分子之一。近年來實驗研究證實GRP78與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；靶向GRP78的研究也為糖尿病慢性并發(fā)癥的治療提供了新思路和新方法。

GRP78；糖尿病慢性并發(fā)癥；作用機制

目前，糖尿?。―iabetes mellitus，DM）已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大疾病。2011年全世界約有3.66億DM患者，至2030年將超過4.39億甚至達5.52億人[1-2]。DM特別是后期引起的各種慢性并發(fā)癥，因多系統(tǒng)和多種器官受損，導致死亡率升高。

DM慢性并發(fā)癥可遍及全身各重要器官，但發(fā)病機制復雜，目前未完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是引起DM及慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制之一[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊、運輸以及儲存鈣的主要場所，當機體功能紊亂出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及細胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose regulated protein 78kD，GRP78）是ERS的標志性分子之一[5-7]，是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上主要的分子伴侶蛋白，屬于熱休克蛋白70家族的一員。GRP78主要參與阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡，以及啟動未折疊蛋白反應等細胞生命過程。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GRP78與基因的表達水平異常及DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。GRP78參與糖尿病性動脈粥樣硬化、糖尿病腎病、糖尿病腦病等多種慢性并發(fā)癥的病理過程，已有研究報道主要表現(xiàn)在以下幾方面。

1 糖尿病大血管病變

糖尿病性動脈粥樣硬化（Diabetic atherosclerosis，DA）是DM大血管并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為主動脈、冠狀動脈、腦動脈、腎動脈和肢體外周動脈等血管病變，然而，其發(fā)病機制復雜，尚未完全闡明。

ERS標志分子GRP78與DA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。董曉光等[8]用高脂高糖飲食聯(lián)合喂養(yǎng)apoE-/-/LDLR-/-雄性小鼠6周后，腹腔單次注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)100 mg/kg誘導建立2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）動脈粥樣硬化小鼠模型，檢測GRP78等在主動脈根部的表達。研究結(jié)果顯示:在apoE-/-/LDLR-/-小鼠10周齡時主動脈組織GRP78mRNA的基因表達水平明顯上調(diào)并持續(xù)至18周；同時，該小鼠GRP78在主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)表達水平也上調(diào)；18周齡時，主動脈粥樣硬化斑塊中膜平滑肌的GRP78表達水平亦上調(diào)。

在治療方面，Kurokawa等[9]用8周齡雄性倉鼠單次腹腔注射STZ（30 mg/kg）誘導DM主動脈應激，免疫組織化學和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RTPCR)結(jié)果顯示:ERS標志物GRP78和mRNA基因的表達水平上調(diào)。4-苯丁酸鈉治療后可下調(diào)GRP78和mRNA基因表達水平，但并不能改善主動脈動脈粥樣硬化病變。

此外，高血糖誘導的血管細胞內(nèi)ERS被認為是DA和心血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。Schisano等[10]用高糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ERS，采用Western blotting法評估ERS標志分子GRP78等蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)與對照組比，高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ERS GRP78等標志物表達水平均上調(diào)，同時胰高血糖素樣肽-1類似物利拉魯肽可下調(diào)GRP78等的表達，對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ERS有抑制作用并呈現(xiàn)劑量依賴性。

2 糖尿病微血管病變

2.1 糖尿病腎病

糖尿病腎?。╠iabetic Nephropathy，DN）是DM微血管病變的主要表現(xiàn)形式之一，也是導致終末期腎病第一位或第二位的病因。終末期腎病需維持性腎臟替代治療，是DM的主要死亡原因之一。目前DN發(fā)病機制尚不明確，已有研究顯示GRP78與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Cao等[11]用大鼠單側(cè)腎切除聯(lián)合單次腹腔注射STZ 65 mg/kg誘導DN模型。8周后免疫組織化學檢測GRP78等ERS蛋白的表達水平和分布。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，GRP78在糖尿病腎臟腎小球和腎小管上皮細胞表達水平上調(diào)。

在治療方面，齊偉等[12]采用高糖高脂飲食聯(lián)合左腎切除及腹腔單次注射STZ建立DN大鼠模型。免疫組織化學和實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示: DN大鼠GRP78和mRNA基因表達水平顯著上調(diào)；4-苯基丁酸治療12周顯著下調(diào)DN大鼠腎組織中GRP78和mRNA基因表達水平。Sun等[13]采用雄性SD大鼠腹腔單次注射STZ 60 mg/kg誘導DN模型，并給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑培哚普利治療24周后，發(fā)現(xiàn)培哚普利減少DN大鼠腎小管細胞凋亡，可能與ERS GRP78等蛋白表達水平下調(diào)有關(guān)。

此外，足細胞是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵靶細胞之一。曹延萍等[14]研究顯示:高糖刺激分別處理足細胞 12、24、48、72 h后，足細胞內(nèi) GRP78等蛋白和mRNA基因表達水平較對照組上調(diào)。研究提示: ERS標志分子GRP78參與了高糖誘導的腎小球足細胞損傷。

2.2 糖尿病心肌病

糖尿病心肌病 （diabetic cardiomyopathy，DCM）主要表現(xiàn)為心臟微血管病變和心肌代謝紊亂及引起的心肌廣泛灶性壞死，并可誘發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死等。GRP78在DCM的發(fā)生發(fā)展和治療中亦引起了關(guān)注與重視。

馬偉斌等[15]用Wistar大鼠高脂高糖飼養(yǎng)4周后腹腔注射STZ 35 mg/kg制備DCM大鼠模型并觀察4周。研究結(jié)果顯示:心肌組織GRP78等蛋白和mRNA基因表達水平上調(diào)，予葛根素80 mg/（kg·d）治療6周后能下調(diào)心肌GRP78和基因的表達水平。研究提示:GRP78可能是葛根素心肌保護作用的靶點之一。

在治療方面，Younce等[16]發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1受體激動劑Exendin-4對心肌細胞有保護作用，通過下調(diào)高糖誘導的新生大鼠心肌細胞GRP78和CCAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）的表達水平從而減少心肌細胞凋亡。Liu等[17]用胰高血糖素樣肽-1模擬肽治療大鼠DCM后顯示:胰高血糖素樣肽-1模擬肽改善心功能，顯著下調(diào)大鼠心肌GRP78等蛋白和基因的表達水平，并且這種改善作用獨立于血糖控制之外。

2.3 糖尿病性視網(wǎng)膜病變

糖尿病性視網(wǎng)膜病變 （Diabetic retinopathy，DR）是DM最常見和最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是DM患者視力喪失的主要原因。引起DR的具體機制目前尚不清楚，ERS標志蛋白GRP78與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

DR早期特征是視網(wǎng)膜微血管周細胞的損傷。Fu等[18]研究發(fā)現(xiàn)高度氧化的糖化低密度脂蛋白誘導人視網(wǎng)膜微血管周細胞ERS分子GRP78的表達水平上調(diào)；ERS導致的線粒體功能障礙和細胞凋亡、自噬與周細胞的丟失密切相關(guān)。

也有相關(guān)研究認為DR早期可能是通過ERS介導的，但不引起GRP78的變化。Li等[19]對人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞在不同濃度葡萄糖的存在下GRP78、CHOP等的mRNA和蛋白表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示:CHOP的表達水平明顯上調(diào)，細胞凋亡明顯增加，而GRP78表達水平不變。研究提示: GRP78的表達水平可能與選取檢測的視網(wǎng)膜微血管細胞種類及時間點的不同有關(guān)。

3 糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥

3.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變

糖尿病腦病 （diabetic encephalopathy，DE）是DM中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性并發(fā)癥之一。其主要表現(xiàn)為輕中度的認知功能障礙、學習和記憶能力下降。目前DE的發(fā)病機制具體尚不清楚。腦星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在數(shù)目占絕對優(yōu)勢的一類大膠質(zhì)細胞，被認為在神經(jīng)元的整個發(fā)育過程中起重要作用。Lind等[20]研究發(fā)現(xiàn)在體外高糖培養(yǎng)4周的星形膠質(zhì)細胞中GRP78等表達水平低于低糖培養(yǎng)組。研究提示:高糖誘導星形膠質(zhì)細胞ERS與葡萄糖消耗的濃度和培養(yǎng)周期有關(guān)。

3.2 周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變

糖尿病性周圍神經(jīng)病變 （diabetic peripheral neuropathy，DPN）是DM導致的神經(jīng)病變中最為常見的一種，其病變早期呈現(xiàn)相對可逆性，后期多發(fā)展為頑固性難治性神經(jīng)損傷，是DM致殘的主要原因之一。

Lupachyk等[21]用Zucker肥胖型DM大鼠模型研究發(fā)現(xiàn):ERS分子 GRP78等蛋白表達水平在Zucker大鼠坐骨神經(jīng)中明顯上調(diào)。研究結(jié)果表明: ERS在DPN過程中扮演了重要角色。

4 其他

4.1 非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病 （non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是DM尤其是T2DM一種較為常見的肝臟并發(fā)癥。毛劉鋒等[22]用低密度脂蛋白受體基因突變小鼠LDLR-/-高脂聯(lián)合單次腹腔注射STZ（100 mg/kg）建立NAFLD模型，研究顯示10周齡和18周齡的T2DM鼠肝臟GRP78等mRNA的表達水平顯著上調(diào)，并與肝臟游離脂肪酸和甘油三酯的增高具有一致性。研究提示:ERS在T2DM小鼠脂肪肝發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，并參與調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)的合成與代謝過程。

4.2 腦缺血

Srinivasan等[23]用高脂飲食及小劑量STZ建立T2DM大鼠模型基礎上大腦中動脈閉塞2 h后再灌注22 h誘導局灶性腦缺血，研究結(jié)果顯示:DM大鼠缺血/再灌注組與對照組比，大腦組織表現(xiàn)為較大的腦梗塞體積、較嚴重的神經(jīng)功能缺損和顯著上調(diào)的GRP78等蛋白表達水平。研究提示:DM腦缺血/再灌注損傷的加重可能與ERS的激活有關(guān)。

5 中醫(yī)藥研究

梁麗娜等[24]用雄性SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合單次腹腔注射1%STZ溶液建立DM模型。DM模型成功基礎上通過疲勞過度加饑飽失常的復合因素建立脾氣虛證模型，之后造模大鼠灌服傷陰藥（方含吳茱萸、附子、肉桂），建立脾陰虛DE病證結(jié)合模型；通過跳臺實驗和水迷宮實驗進行行為學測試，驗證DE模型的成功，以滋補脾陰方藥（方含人參、山藥、白芍、扁豆、茯神、檀香等）治療；Western Blotting檢測各組大鼠海馬GRP78等蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)滋補脾陰方藥可以改善脾陰虛DE大鼠學習記憶障礙，其機制可能與下調(diào)GRP78等蛋白表達水平有關(guān)。常曉慧等[25]用雄性SD大鼠腹腔單次注射1%的STZ建立T2DM模型，發(fā)現(xiàn)T2DM海馬GRP78等蛋白表達水平上調(diào)。中藥金智達（主要為人參、遠志提取物及綠茶提取物茶氨酸和茶多酚）具有降低GRP78等蛋白表達水平，抑制ERS，改善認知功能的作用。

6 結(jié)語

DM慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，與多方面因素的相互影響有關(guān)。高糖環(huán)境是DM及其并發(fā)癥的主因，血糖增高通過多種機制在DM慢性并發(fā)癥中扮演重要角色。各種機制可單獨出現(xiàn)或同時或先后出現(xiàn)，并最終對心、腦、腎等重要靶器官造成損害。因此，明確DM慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制對臨床防治將具有重要意義。ERS作為一種較新的機制在DM慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用，也逐漸引起了關(guān)注與重視。GRP78作為ERS標志分子之一，其蛋白和（或）基因的異常表達與DM多種慢性并發(fā)癥相關(guān)。因而，以GRP78為靶向的研究對臨床治療具有較重要的意義。此外，近年來在DM慢性并發(fā)癥治療方面，相關(guān)研究還提示從根本上改善或解除ERS賴以產(chǎn)生和發(fā)展的條件，就可延緩DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展；同時，ERS凋亡信號分子CHOP等蛋白及基因表達水平在DM多種慢性并發(fā)癥病理過程中也異常，因此，在此方面的研究也值得進一步的探討。

[1]Whiting DR，Guariguata L，Weil C，et al.IDF diabetes atlas:global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract，2011，94(3):311-321.

[2]Shaw JE， Sicree RA， Zimmet PZ.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract，2010，87(1):4-14.

[3]Takada A，Miki T，Kuno A，et al.Role of ER stress in ventricular contractile dysfunction in type 2 diabetess[J].PLoS One，2012，7(6):e39893.

[4]Lakshmanan AP，Harima M，Suzuki K，et al.The hyperglycemia stimulated myocardial endoplasmic reticulum (ER) stresscontributes to diabetic cardiomyopathy in the transgenic non-obese type 2 diabetic rats:a differential role of unfolded protein response(UPR)signaling proteins[J].Int J Biochem Cell Biol，2013，45(2):438-447.

[5]Zhang J，Tang J，Cao B，et al.The Natural Pesticide Dihydrorotenone Induces Human Plasma Cell Apoptosis by Triggering Endoplasmic Reticulum Stress and Activating p38 Signaling Pathway[J].PLoS One，2013，8(7):e69911.

[6]Firczuk M，Gabrysiak M，Barankiewicz J，et al.GRP78-targeting subtilase cytotoxin sensitizes cancer cells to photodynamic therapy[J].Cell Death Dis，2013（4）:e741.

[7]Martin S， Lamb HK， BradyC， etal.Inducingapoptosis of cancer cells using small-molecule plant compounds that bind to GRP78[J].Br J Cancer，2013，109(2):433-443.

[8]董曉光.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子在2型糖尿病小鼠主動脈中的表達研究[D].濟南:山東師范大學碩士學位論文，2010:1-83.

[9]Kurokawa M，Hideshima M，Ishii Y，et al.Aortic ER stress in streptozotocin-induced diabetes mellitus in APA hamsters[J]. Exp Anim，2009，58(2):113-121.

[10]Schisano B， Harte AL， Lois K， etal.GLP-1 analogue， Liraglutide protects human umbilicalvein endothelial cells against high glucose induced endoplasmic reticulum stress[J].Regul Pept，2012，174(1-3):46-52.

[11]Cao YP，Hao YM，Liu QJ，et al.The relationship between endoplasmic reticulum stress and its particular apoptosis way caspase-12 and apoptosis in renal cortex of diabetic rats [J].Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi，2011，27(2): 236-240.

[12]齊 偉.調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對大鼠糖尿病腎病的治療及機制研究[D].重慶:第三軍醫(yī)大學碩士學位論文，2011:1-71.

[13]Sun HL，Sun L，Li YY，et al.ACE-inhibitor suppresses the apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in renal tubular in experimental diabetic rats[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2009，117(7):336-444.

[14]曹延萍.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在糖尿病腎損害過程中的作用及其機制研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學博士論文，2011:18-99.

[15]馬偉斌，江榮林，雷 澍，等.葛根素對糖尿病心肌病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響[J].浙江醫(yī)學，2012，34(24):1 964.

[16]Younce CW，Burmeister MA，Ayala JE.Exendin-4 attenuates high glucose-induced cardiomyocyte apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress and activation of SERCA2a[J].Am J Physiol Cell Physiol，2013，304(6):C508-518.

[17]Liu J，Liu Y，Chen L，et al.Glucagon-Like Peptide-1 Analog Liraglutide Protects against Diabetic Cardiomyopathy by the Inhibition of the Endoplasmic Reticulum Stress Pathway[J].J Diabetes Res，2013，2013:630537.

[18]Fu D，Wu M，Zhang J，et al.Mechanisms of modified LDL-induced pericyte loss and retinal injury in diabetic retinopathy [J].Diabetologia，2012，55(11):3128-3140.

[19]Li B，Wang HS， Li GG， et al.The role of endoplasmic reticulum stress in the early stage of diabetic retinopathy[J]. Acta Diabetol，2011，48(2):103-111.

[20]Lind KR，Ball KK，Cruz NF，et al.The unfolded protein response to endoplasmic reticulum stress in cultured astrocytes and rat brain during experimental diabetes[J].Neurochem Int，2013，62(5):784-795.

[21]Lupachyk S， Watcho P， Obrosov AA， et al.Endoplasmic reticulum stress contributes to prediabetic peripheral neuropathy [J].Exp Neurol，2013（247）:342-348.

[22]毛劉鋒，姜小偉，秦 艷，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對2型糖尿病小鼠脂肪肝發(fā)生的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17(1):4-10.

[23]Srinivasan K，Sharma SS.Augmentation of endoplasmic reticulum stressin cerebralischemia/reperfusion injury associated with comorbid type 2 diabetes[J].Neurol Res，2011，33(8): 858-865.

[24]梁麗娜.滋補脾陰方藥對脾陰虛糖尿病腦病大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激影響的研究[D].大連:大連醫(yī)科大學碩士學位論文，2009:1-50.

[25]常曉慧.組分中藥金智達對認知功能的改善及其相關(guān)機制的研究[D].大連:大連醫(yī)科大學博士學位論文，2012:1-92.

（本文編輯 楊 瑛）

Research of the effects of glucose regulated protein 78 on chronic diabetic complications

CHEN Cong,YU Rong,WU Yongjun
(Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Glucose regulated protein 78 (GRP78)is a main molecular chaperone protein in the endoplasmic reticulum and one of the marker molecules of endoplasmic reticulum stress.In recent years,experimental studies are confirmed that GRP78 is correlated with the occurrence and the developmentofchronic complicationsofdiabetes.The studiesoftargeted GRP78 are provided new approaches for the treatment of chronic diabetic complications.

GRP78;chronic diabetic complications;mechanism of action

Q71；R587.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.016.053.04

2013－10－10

國家自然科學基金面上項目（81273753）；湖南省自然科學基金（12JJ2048）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2013B321）。

陳 聰，女，湖南中醫(yī)藥大學2012級博士研究生，研究方向:內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)辨證規(guī)律及其防治研究。

*喻 嶸，女，教授，博士研究生導師，E-mail:yuron@21cn.com。