彭慧珍劉 敏劉巧林肖調(diào)義蘇建明許寶紅劉宇潔

赤眼鱒Mx基因全長(zhǎng)cDNA克隆及其經(jīng)GCRV攻毒后的組織表達(dá)分析

彭慧珍1*劉 敏1*劉巧林1肖調(diào)義1蘇建明2許寶紅1劉宇潔1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410128; 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128)

為研究赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)的功能, 采用簡(jiǎn)并PCR和SMART RACE方法從赤眼鱒脾臟中克隆得到Mx基因全長(zhǎng)cDNA, 并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析其同源性,再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)其在脾、肝、腸、腎等9個(gè)組織中的表達(dá), 以及感染草魚(yú)呼腸孤病毒(Reovirus of Grass carp) GCRV-104后不同時(shí)間點(diǎn)赤眼鱒Mx的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明: 赤眼鱒Mx基因cDNA序列(ScMx)全長(zhǎng)2325 bp, 包含5′-UTR 40 bp, 3′-UTR 371 bp和ORF 1884 bp, 共編碼627個(gè)氨基酸, 其編碼的Mx蛋白分子量約為70.9 kD, 理論等電點(diǎn) pI 為 8.25, 具有脊椎動(dòng)物Mx蛋白共有的結(jié)構(gòu)特征; 赤眼鱒Mx與鯽魚(yú)Mx3同源性最高; Mx在赤眼鱒脾、肝、腸、腎等9個(gè)組織中均有表達(dá), 其中肝臟中的相對(duì)表達(dá)量最高, 脾臟次之, 腸組織中的表達(dá)量最低; 經(jīng)GCRV-104病毒感染刺激后, ScMx在肝和脾組織中的表達(dá)量顯著上調(diào), 均在48h到達(dá)峰值, 分別為對(duì)照組的10倍(肝)和5倍(脾), 且在這兩個(gè)組織中的表達(dá)模式相似,均表現(xiàn)為先升高后下降的波動(dòng)型變化趨勢(shì)。研究表明ScMx參與了赤眼鱒抗GCRV-104病毒的免疫反應(yīng)。

赤眼鱒; Mx基因; 全長(zhǎng)cDNA; 組織表達(dá)

Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)最早于1962年在近交小鼠系 A2G的研究中發(fā)現(xiàn)并命名。1988年, Meier等在大鼠中發(fā)現(xiàn)有 3個(gè)不同的分型Mx1、Mx2、Mx3[1]。隨后在人、豬、馬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)等其他物種中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白的存在[2]。Mx蛋白是一類由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的 GTP酶活性蛋白, 大多被認(rèn)為具有廣譜抗病毒功能。對(duì)多種RNA病毒和DNA病毒有抑制作用。

魚(yú)類的Mx蛋白被認(rèn)為具有部分抗病毒活性。大西洋鮭(Salmo salar) Mx1蛋白被證實(shí)對(duì)傳染性胰壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus genus, IPNV)有明顯的抑制作用[3]。Robertsen用抑制性消減cDNA文庫(kù)的方法發(fā)現(xiàn)出血性敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)能誘導(dǎo)分離自虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的白細(xì)胞中Mx和其他免疫球蛋白的表達(dá)[4]。但也有研究表明大西洋鮭的Mx1對(duì)貧血病毒(Infectious Salmon Anaemia Virus, ISAV) 7i 編碼的蛋白沒(méi)有抑制作用[5]。

近年來(lái), 研究者已在多種魚(yú)類上發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白,如草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)[6]、鱖(Siniperca chuasti)[7]、石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)[8]、虹鱒[9]、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)[10]、大西洋鮭[11]、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[12]、鯽(Carassius auratus)[13]、尖吻鱸(Lates calcarifer)[14]等。

赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類, 在養(yǎng)殖過(guò)程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗病力, 但對(duì)其免疫方面的研究卻鮮有報(bào)道[15],更未見(jiàn)赤眼鱒 Mx基因的相關(guān)報(bào)道。本研究以赤眼鱒為研究對(duì)象, 克隆其Mx基因的cDNA全長(zhǎng), 并對(duì)該基因在赤眼鱒中的組織表達(dá)規(guī)律及經(jīng)草魚(yú)呼腸孤病毒(Reovirus of grass carp) GCRV-104感染刺激后赤眼鱒肝臟和脾臟組織中 ScMx的表達(dá)模式進(jìn)行了探討, 為進(jìn)一步研究赤眼鱒 Mx蛋白的功能和其他后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用赤眼鱒為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地養(yǎng)殖的1+齡魚(yú), 體重為(90±10) g。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后, 置于室內(nèi)水族箱中暫養(yǎng)一星期后, 挑選健康的赤眼鱒作為實(shí)驗(yàn)材料。

GCRV-104由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所提供, 草魚(yú)腎臟組織細(xì)胞CIK培養(yǎng)下病毒滴度經(jīng)測(cè)定為TCID50=108.710。

1.2 方法

總RNA提取 采集的組織在液氮下研磨成粉末狀, 加入 RNAiso Plus試劑(TaKaRa)按操作說(shuō)明提取組織的總 RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。RNA樣品置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA模板合成 用于片段擴(kuò)增的cDNA模板(普通cDNA模板)按照BioTeke superRTKit (Bio-Teke)合成備用; 5′-RACE Ready cDNA和3′-RACE Ready cDNA的制備根據(jù) SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)的操作要求合成備用;熒光定量(Real-Time PCR)用 cDNA 模板使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Ta-KaRa)合成備用。

RT-PCR擴(kuò)增及ScMx序列分析 所有引物均在上海生工合成(表1)。通過(guò)比對(duì)已知魚(yú)類的Mx基因序列, 找到其相對(duì)保守序列, 并根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)Mx片段1擴(kuò)增引物MxF和MxR。再以片段1及與其同源性最高的鯽魚(yú)和稀有鯽的3′端保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩條特異性引物3S1和3S2及一條簡(jiǎn)并引物3R擴(kuò)增出Mx基因片段2。最后基于兩段片段的拼接結(jié)果分別設(shè)計(jì)5′端特異性引物(5W和5N)和3′端特異性引物(3W和3N)用于RACE-PCR。Mx片段1和Mx片段2均用健康赤眼鱒脾臟的cDNA模板擴(kuò)增。Mx片段1 PCR反應(yīng)體系如下: 10×Ex PCR buffer 2.5 μL, dNTP Mixture 2.0 μL, MxF2 (10 μmol/L) 1.0 μL, MxR2 (10 μmol/L) 1.0 μL, cDNA 2 μL, Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, 加 H2O補(bǔ)充體積至25 μL。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94 ℃30s, 58 ℃ 40s, 72 ℃ 2min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸7min。Mx片段2采用巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增, 反應(yīng)體系如下: 10×Ex PCR buffer 2.5 μL, dNTP Mixture 2.0 μL, 3S1 (10 μmol/L) 1.0 μL, 3R (10 μmol/L) 1.0 μL, cDNA 2 μL, Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, 加ddH2O補(bǔ)充至25 μL。第一輪反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94 ℃ 30s, 55 ℃ 40s, 72 ℃ 2min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸7min。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL為模板, 將3S1引物替換為3S2, 其他條件同第一輪擴(kuò)增。5′RACE和3′RACE擴(kuò)增分別以 5′-RACE Ready cDNA和 3′-RACE Ready cDNA為模板, 實(shí)驗(yàn)流程參照 SMARTTMRACE試劑盒進(jìn)行。此外, 我們也進(jìn)行了赤眼鱒Mx ORF序列的驗(yàn)證, 以赤眼鱒脾臟cDNA為模板, 用引物ScMxORF3和ScMxORF4進(jìn)行PCR, 擴(kuò)增了包含ScMx ORF的cDNA序列, 產(chǎn)物測(cè)序后與拼接序列完全相同。

Real-Time PCR 表達(dá)分析 用 Real-Time PCR檢測(cè)赤眼鱒 ScMx的組織表達(dá)及經(jīng) GCRV-104病毒感染刺激后赤眼鱒肝臟和脾臟組織的免疫應(yīng)答。對(duì)于組織表達(dá)實(shí)驗(yàn), 隨機(jī)取 4條魚(yú), 分別提取脾、肝、腸、腎、頭腎、心、腦、鰓和肌肉9個(gè)組織的總RNA并按上述步驟獲得cDNA模板; 對(duì)于GCRV-104病毒刺激實(shí)驗(yàn), 設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組, 試驗(yàn)時(shí)水溫為 28—30℃。實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)注射 0.2 mL GCRV-104病毒液, 對(duì)照組每尾魚(yú)注射等體積的PBS緩沖液。在0、6、12、24、48、72、96、120h 8個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取四條魚(yú)的肝臟和脾臟組織, 并按上述步驟制備其cDNA模板。根據(jù)ScMx的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)Real-Time PCR引物QT-MxF和QT-MxR, 并設(shè)計(jì)β-actin引物作為內(nèi)參, Real-Time PCR反應(yīng)在iCycler iQTM5熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行。根據(jù)TransStartTMTop Green qPCR SuperMix (全式金)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL, 包含12.5 μL的2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix, 0.5 μL的Passive Reference Dye Ⅲ , 1 μL模板, 0.6 μL的引物 (10 μmol/L) 和10.4 μL的滅菌雙蒸水。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù), 以蒸餾水代替模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū),退火溫度為61 ℃ , 用2–△△Ct法分析其相對(duì)表達(dá)值。用SAS9.2軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析, P＜0.05表示差異顯著, P＜0.01表示差異極顯著。

表1 本研究中所用引物的名稱及序列Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 赤眼鱒ScMx全長(zhǎng)cDNA序列及其分析

赤眼鱒ScMx cDNA全長(zhǎng)為2325 bp, GenBank中的序列號(hào)為 KC249972。其中包括 40 bp的5′-UTR、1884 bp的ORF和371 bp的3′-UTR, 共編碼 627個(gè)氨基酸。在 PolyA上游 19 bp有典型的mRNA加尾信號(hào)“AATTAAA”。預(yù)測(cè)的Mx蛋白相對(duì)分子量為70.9 kD, 理論等電點(diǎn)為8.25, 為弱堿性蛋白。序列比對(duì)分析結(jié)果表明赤眼鱒 Mx基因編碼區(qū)中含有一個(gè)三聯(lián)體 GTP結(jié)合區(qū)域“GDQSSGKS”、“DLPG”、“TKPD”和一個(gè)發(fā)動(dòng)蛋白簽名序列“LPRGTGIVTR”, 以上基序在已知物種的 Mx蛋白中普遍存在。對(duì)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示, 赤眼鱒Mx蛋白N端包含一個(gè)發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶結(jié)合區(qū)域(Dynamin, GTPase domain, 19—265aa),發(fā)動(dòng)蛋白的中央核心結(jié)構(gòu)域(Dynamin central domain)位于236—523aa, C端為發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Dynamin, GTPase effector domain, 538—627aa)(圖1)。PSORTⅡ程序預(yù)測(cè)表明赤眼鱒Mx蛋白存在一明顯的核定位信號(hào)序列NLS(PKRR, 601— 604aa)(圖2)。

圖1 Mx編碼蛋白Smart功能域預(yù)測(cè)Fig. 1 The prediction of functional domains of Mx by Smart software

2.2 赤眼鱒ScMx蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用SWISS-MODEL在線程序?qū)Τ嘌埙VMx的氨基酸序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模, 參與模型構(gòu)建的氨基酸范圍為18—625aa, 參考模板為人MxA(基因登錄號(hào)為 3szrA), 目標(biāo)蛋白序列與參考模板序列比對(duì)的同源性為47.783%, 且模型評(píng)估E值為0, 說(shuō)明蛋白三級(jí)模型結(jié)構(gòu)可靠。用Rasmol 2.7分析軟件制作其3D結(jié)構(gòu)圖(圖3), 圖A顯示的是按蛋白質(zhì)的N端到C端氨基酸殘基依次顯示為紅、橙、 黃、綠、藍(lán); 圖B中紅、黃、藍(lán)、白分別表示α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和其他殘基。該模型中總共包括21個(gè)α螺旋、11個(gè) β折疊、50個(gè)轉(zhuǎn)角和 420個(gè)氫鍵。其中ScMx的509—540位點(diǎn)包含3個(gè)β折疊(圖3B中箭頭所示)。

將推導(dǎo)的ScMx蛋白的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源比對(duì), 結(jié)果表明ScMx與鯽魚(yú)Mx3(AAP68827.1)和稀有鯽Mx(ABL61237.1)的相似性最高, 分別為 93%和90%。與其他鯉科魚(yú)類(斑馬魚(yú)和草魚(yú))Mx相似率較高, 為 70%—88%。與其他物種的相似率在 50%—53%。采用Mega5.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4),從進(jìn)化樹(shù)上可看出赤眼鱒 Mx與鯽 Mx3首先聚類,再依次與鯉形目的稀有鯽、草魚(yú)、斑馬魚(yú)的 Mx聚為一個(gè)分支 A。大西洋鮭、石斑魚(yú)、大菱鲆、歐洲鰻鱺等鱸形目、鯡形目其他魚(yú)類Mx聚為另外一個(gè)分支B。鳥(niǎo)綱的雞、鴨Mx聚為一個(gè)分支C。哺乳類動(dòng)物人和老鼠Mx聚為分支D。進(jìn)化樹(shù)反映的親緣關(guān)系與物種的進(jìn)化地位基本一致。

2.3 赤眼鱒ScMx組織表達(dá)特征

采用RT-qPCR分析了赤眼鱒ScMx的組織表達(dá)特征, 先對(duì)ScMx和β-actin引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行了檢測(cè), 兩者擴(kuò)增效率基本相同, 溶解曲線為單一峰,證明所設(shè)計(jì)引物適合 2–△△Ct法分析基因相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR組織表達(dá)結(jié)果(圖5)顯示, 赤眼鱒ScMx mRNA在脾臟、肝臟、腸、腎臟、頭腎、心臟、鰓、腦和肌肉中均有表達(dá)。其中肝臟中表達(dá)量最高,脾臟中次之, 其次是心臟和鰓組織, 腸組織中最低。肝臟、脾臟、心臟和鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05)。

圖2 ScMx cDNA全序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Full-length cDNA of ScMx and its deduced amino acid sequence

2.4 GCRV病毒感染刺激后赤眼鱒ScMx的免疫應(yīng)答病毒GCRV-104感染刺激后0、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h(同時(shí)以注射PBS后的各時(shí)間點(diǎn)為對(duì)照), 熒光定量 RT-PCR檢測(cè)了赤眼鱒 ScMx在肝臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果(圖6)表明: 與注射 PBS緩沖液的對(duì)照組相比, 肝臟和脾臟中的ScMx的相對(duì)表達(dá)量上調(diào), 在兩個(gè)組織中的表達(dá)模式類似, 均表現(xiàn)為先上升后下降的的波動(dòng)型變化趨勢(shì),并在48h時(shí)達(dá)到峰值, 分別為對(duì)照組的10倍(肝)和5.5倍(脾)。肝和脾在攻毒后48h相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.01)。同時(shí), 這兩個(gè)組織在攻毒后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量也極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。(表2)。

圖3 赤眼鱒Mx蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源模型Fig. 3 The homologous model of tertiary structure of ScMx

圖4 基于部分物種Mx蛋白氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 The NJ phylogenetic tree based on the amino acid sequences of Mx proteins of some species

圖5 熒光定量PCR檢測(cè)赤眼鱒ScMx mRNA組織表達(dá)Fig. 5 Expression analysis of ScMx by RT-qPCR in different tissues

3 討論

圖6 感染草魚(yú)呼腸孤病毒后赤眼鱒Mx基因的時(shí)空表達(dá)特征Fig. 6 Expression pattern of ScMx after infected by GCRV-104

表2 肝臟和脾臟在攻毒后在不同時(shí)間點(diǎn)以及與對(duì)照組之間的時(shí)序表達(dá)差異Tab. 2 The expression of ScMx in the liver and spleen at each time point after GCRV-104 infection

赤眼鱒屬于鯉科雅羅魚(yú)亞科赤眼鱒屬, 與同屬雅羅魚(yú)亞科的草魚(yú)外形酷似而被稱為野草魚(yú)。近年來(lái), 赤眼鱒作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類, 被越來(lái)越多的研究者所關(guān)注[15]。本研究通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到赤眼鱒Mx基因的全長(zhǎng)cDNA序列, 熒光定量PCR分析其在人工感染草魚(yú)呼腸孤病毒后各組織中表達(dá)量的變化規(guī)律。序列分析表明, 由赤眼鱒 Mx cDNA推導(dǎo)的蛋白包含N端發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶結(jié)合區(qū)域、發(fā)動(dòng)蛋白的中央核心結(jié)構(gòu)域和C端的發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶效應(yīng)區(qū)(GTPase effector domain, GED), 是典型的發(fā)動(dòng)蛋白家族成員[16]。氨基酸同源性 Blast分析表明赤眼鱒Mx與鯽魚(yú)Mx3的相似率最高, 與其他鯉科魚(yú)類 Mx的相似率次之, 與其他物種的相似率較低。以人、小鼠、雞、鴨和部分魚(yú)類 Mx構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與同源比對(duì)的結(jié)果相類似, 鯉科魚(yú)類Mx聚為一支, 其他魚(yú)類Mx聚為另一分支, 與雞、鴨和人、鼠聚成的另外兩個(gè)分支親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 其結(jié)果與物種的進(jìn)化地位相一致。

在人、鼠、豬、牛等哺乳動(dòng)物和雞、鴨等禽類中發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白的不同亞型, 如人MxA和MxB, 大鼠Mx1、Mx2和Mx3, 小鼠Mx1和Mx2, 豬[17]對(duì)流感病毒和水泡性口炎病毒有活性的 Mx1 (76 kD)和無(wú)此活性的Mx2 (73 kD)等。魚(yú)類Mx蛋白也有數(shù)量不等的多種亞型: 斑馬魚(yú)(Danio rerio)[18]7種; 斑點(diǎn)叉尾[19]5種; 虹鱒[9]、大西洋鮭[20]、金頭鯛(Sparus aurata)[21]、橫帶石鯛(Oplegnathus fasciatus)[22]、鯽(金魚(yú))[13]、草魚(yú)[23]分別有 3種; 大西洋大比目魚(yú)(Hippoglossus hippoglossus)[24]和 大 菱 鲆 (Scophthalmus maximus)[25]中分別發(fā)現(xiàn)了 2種; 日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)[26]、塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)[27]、稀有鯽[28]、鱖[7]、點(diǎn)帶石斑魚(yú)[8]、尖吻鱸[14]等中分別只發(fā)現(xiàn)1種。本研究中僅從赤眼鱒中克隆得到一種 Mx基因, 其推導(dǎo)的氨基酸序列與鯽Mx3和稀有鯽Mx的同源性最高。在三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模時(shí), Swiss-Model給出的參考序列為人MxA (3szrA), 同源性為47.783%。彭麗敏等[23]發(fā)現(xiàn)草魚(yú)的Mx1、Mx2和Mx3(CiMx1、CiMx2和CiMx3)三級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)別僅在于氨基酸509-540位點(diǎn): CiMx1為2個(gè)β折疊、CiMx2為1個(gè)α螺旋、CiMx3為2個(gè)α螺旋。本研究中的赤眼鱒Mx三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示在該位點(diǎn)為3個(gè)β折疊(圖3B中白色箭頭所示), 與草魚(yú)的三個(gè)亞型中CiMx1的結(jié)構(gòu)最接近。赤眼鱒中是否和其他魚(yú)類一樣存在其他的Mx亞型有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

不同物種 Mx基因在健康個(gè)體中表達(dá)情況有所不同。肖志廣等[24]發(fā)現(xiàn)未經(jīng)干擾素誘導(dǎo)的ICR小鼠中, Mx1在脾、肺、肝、心、腎中均有表達(dá), 在肌肉中不表達(dá)。Lee等[25]RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Mx主要在健康牙鲆中的腎、腸、腦、鰓、腹膜腔液等處表達(dá), 而在血液白細(xì)胞、肝、肌肉和黏液中僅微量表達(dá)。彭麗敏等通過(guò)半定量 RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú) Mx1、 Mx2、Mx3在健康草魚(yú)的肝胰腺、脾臟、鰾、前腸、中腸、后腸、腦、血液、皮膚等15個(gè)組織中均有表達(dá), 其中鰓和頭腎中的表達(dá)量最高, 眼、肌肉和皮膚中的表達(dá)量較低。在本研究中, 熒光定量PCR結(jié)果顯示 Mx基因在健康赤眼鱒的肝、脾、腸、鰓、頭腎、肌肉中均有表達(dá)。其中肝和脾中表達(dá)量最高,心、鰓中次之, 腸中表達(dá)量最少。魚(yú)類Mx能經(jīng)Poly I:C、細(xì)菌和多種病毒誘導(dǎo)表達(dá)。南亞野鯪(Labeo rohita)經(jīng)Ploy I:C誘導(dǎo)后, 鰓、肝、腎、腸、心、脾、皮膚和血液中 Mx基因的表達(dá)量顯著提高。其中以肝組織中變化最明顯(為對(duì)照組的 600倍), 其次為腎(200倍)、脾(200倍)、心(180倍)、鰓(50倍)、皮膚(50倍)和血液(40倍)。腸組織中最低, 但與對(duì)照組相比有顯著地提高[26]。大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)經(jīng)副溶血弧菌感染2d后頭腎和血液中Mx基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組, 其他各時(shí)(4h、1d、4d、8d、12d、16d)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[27]。Bravo等[28]感染諾達(dá)病毒(Nodavirus, NV)后金頭鯛肝組織中 Mx基因的表達(dá)量增加。注射大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot Reddish Body Iridovirus, TRBIV)后, 大菱鲆Mx基因在所研究的頭腎、脾臟、鰓、肌肉4個(gè)組織中均上調(diào)表達(dá), 其組織中的最大表達(dá)量分別出現(xiàn)在感染后的第1、第4和第5天[29]。草魚(yú)經(jīng)GCRV感染后, 脾組織中Mx 12h時(shí)顯著高于對(duì)照組, 48h時(shí)急劇下降, 72h略微上升。頭腎組織中Mx 12h時(shí)顯著高于對(duì)照組, 48h和72h時(shí)急劇下降。鰓組織中12h和 24h顯著上調(diào), 并且一直持續(xù)到 72h(實(shí)驗(yàn)結(jié)束)[23]。稀有鯽人工感染GCRV后鰓中Mx基因的表達(dá)在12h顯著升高, 直到感染后140h持續(xù)保持高水平表達(dá)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中, 赤眼鱒經(jīng)人工感染草魚(yú)呼腸孤病毒后, 肝和腎組織中 Mx表達(dá)量變化的趨勢(shì)一致, 整體表現(xiàn)為先升高后下降, 在 48h出現(xiàn)表達(dá)量的最高峰。這一結(jié)果與尹湘艷[30]用Poly I:C感染褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)及夏軍[29]注射TRBIV至大菱鲆活體后 Mx表達(dá)量的結(jié)果相似, 不同的是出現(xiàn)峰值的時(shí)間不同。這可能和免疫刺激源的不同及不同物種對(duì)外界免疫應(yīng)答反應(yīng)速度不一有關(guān), 具體原因有待進(jìn)一步研究討論。赤眼鱒在感染GCRV后, Mx基因是上調(diào)表達(dá)的, 說(shuō)明赤眼鱒 Mx可能與赤眼鱒抗病毒途徑緊密相關(guān)。這種免疫相關(guān)性與已報(bào)道研究結(jié)果是一致的[23,26—30]。而在感染后6h即迅速上調(diào)則可能預(yù)示著赤眼鱒通過(guò)Mx蛋白免疫應(yīng)答病毒刺激較其他魚(yú)類更為敏捷。以上結(jié)果表明赤眼鱒 Mx可能在赤眼鱒抗草魚(yú)呼腸孤病毒的免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

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MOLECULAR CLONING AND TISSUE EXPRESSION ANALYSIS OF Mx GENE IN SQUALIOBARBUS CURRICULUS

PENG Hui-Zhen1, LIU Min1, LIU Qiao-Lin1, XIAO Tiao-Yi1, SUN Jian-Ming2, XU Bao-Hong1and LIU Yu-Jie1
(1. Laboratory of Hydrobiology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. College of animal veterinary and medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Mx protein, a GTP-enzyme active protein induced by interferon, exhibits broad-spectrum antiviral activity. As member of economically fresh water fish with superior quality, Squaliobarbus curriculus has the highest fitness and disease resistance; however, studies on its immunity are limited. In the current study, we amplified a full-length cDNA of Mx (ScMx) from the spleen by using degenerate PCR and SMART RACE, and conducted homology analysis and tissue expression analysis of ScMx mRNA in different tissues including liver, spleen, intestine, gill, kidney, head kidney, heart, brain and muscle. Furthermore, we investigated the temporal expression levels of ScMx in the liver and spleen after GCRV-104 infection. The results indicated that the full-length of ScMx gene was 2325 bp consisted of 40 bp 5′-UTR, 371 bp 3′-UTR and 1884 bp ORF encoding 627 amino acids. The theoretical molecular weight and isoelectric point (PI) of ScMx were 70.9 kD and 8.25, respectively. ScMx shared the most homology with Carassius aruatus Mx3. ScMx was broadly expressed in all tested tissues. After infected with GCRV-104, the ScMx expression levels in the liver and spleen showed a tendency of fluctuation: the relative expression of ScMx increased reached the peak at 48h after the viral infection, and then decreased. The infection significantly induced the expression of ScMx (P＜0.05). These results suggested that ScMx may play an important role in the immune response of Squaliobarbus curriculus against GCRV-104 infection.

Squaliobarbus curriculus; Mx gene; Full-length cDNA; Tissue expression analysis

Q344+.1

A

1000-3207(2014)06-0993-09

10.7541/2014.147

2013-01-14;

2014-04-12

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011AA011404); 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31272652)資助

彭慧珍(1981—), 女, 湖南長(zhǎng)沙人; 博士; 主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物健康養(yǎng)殖。E-mail: phz2011cn@163.com劉敏(1988—), 女, 湖南常德人; 碩士; E-mail: 283141785@qq.com *共同第一作者

肖調(diào)義, 主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物遺傳育種。E-mail: tyxiao1128@163.com