張華，王秀全，何丹，龐啟華稅紅霞，盧庭啟，蔣曉芳

（ 四川省綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 綿陽(yáng) 621000）

作物的很多重要農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性、抗病性等均為數(shù)量性狀。相比質(zhì)量性狀，數(shù)量性狀受眾多的微效多基因控制，遺傳效應(yīng)較為復(fù)雜。形態(tài)、生化等傳統(tǒng)標(biāo)記方法由于固有的局限性，難以精確確定相關(guān)基因在染色體上的位置、效應(yīng)及多態(tài)性。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，在構(gòu)建分離群體的基礎(chǔ)上，利用RFLP、SSR等分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析和QTL作圖已成為研究植物數(shù)量性狀的主要方法［1］，常用的QTL作圖法有單標(biāo)記法、區(qū)間作圖法、混合區(qū)間作圖法等，應(yīng)用上述方法定位了很多玉米染色體上與數(shù)量性狀相關(guān)的區(qū)段，但傳統(tǒng)的QTL分析始終存在如下一些問(wèn)題:（1）需要專門構(gòu)建相應(yīng)的作圖群體，時(shí)間成本高。（2）由于分離群體規(guī)模較小，基因重組的次數(shù)有限，QTL作圖的精度一般只能達(dá)到10～30cM，即使運(yùn)用隨機(jī)交配群體，QTL作圖精度的提高也非常有限［2］。（3）QTL作圖僅涉及一個(gè)座位的少數(shù)幾個(gè)基因，只能代表該物種的小部分相關(guān)表型變異［3］。

近年來(lái)，隨著玉米自交系B73測(cè)序工作的完成，大量SNP標(biāo)記相繼被開(kāi)發(fā)，在SNP分子標(biāo)記基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析已成為發(fā)掘玉米數(shù)量性狀基因的重要手段。關(guān)聯(lián)分析 （association analysis）又稱作關(guān)聯(lián)作圖 （association mapping）或連鎖不平衡作圖 （LD mapping），是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定群體內(nèi)目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法［4］。該方法最初用于人類疾病基因的研究，自Thornsberry等［5］于2001年運(yùn)用關(guān)聯(lián)分析對(duì)玉米花期變異進(jìn)行研究后，關(guān)聯(lián)分析已成為玉米基因組學(xué)研究的重要方法。相比傳統(tǒng)的QTL作圖，關(guān)聯(lián)分析具有以下優(yōu)點(diǎn):（1）以已有的自然或人工群體作為基礎(chǔ)材料，無(wú)需構(gòu)建專門的作圖群體，大大縮短了研究周期。（2）作圖精度較高，可以精確定位到染色體的某一區(qū)段。（3）能夠檢測(cè)到更加廣泛的遺傳多樣性，發(fā)掘更多的等位基因多態(tài)性，有利于玉米功能基因的挖掘與功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。

1 新型分子標(biāo)記SNP的定義與特點(diǎn)

分子標(biāo)記技術(shù)相繼經(jīng)歷了RFLP、SSR、RAPD、AFLP等階段，在數(shù)量性狀的發(fā)掘與定位、遺傳多樣性研究以及分子標(biāo)記輔助育種中發(fā)揮著重要的作用。比如SSR分子標(biāo)記不僅可以進(jìn)行連鎖分析，也可以進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。Thornsberry等［5］對(duì)玉米花期變異的研究就是利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定位了與dwarf8基因表達(dá)相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)。但SSR等分子標(biāo)記技術(shù)也存在著一些固有的缺陷，最主要的問(wèn)題就是分子標(biāo)記的低通量以及較低的自動(dòng)化程度，而新型分子標(biāo)記技術(shù)SNP的出現(xiàn)有望改變這一局面。

單核苷酸多態(tài)性 （Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，在群體中的頻率＞1%，相比SSR等分子標(biāo)記，SNP具有如下特點(diǎn):（1）SNP數(shù)量較多、分布廣泛，Wright等［6］對(duì)玉米和大芻草的774個(gè)基因進(jìn)行SNP多樣性比較，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)每124bp就存在1個(gè)SNP，非編碼區(qū)每31bp就存在1個(gè)SNP。（2）SNP相對(duì)穩(wěn)定，與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比，每一代中每個(gè)核苷酸變異頻率極低。（3）SNP作為二態(tài)性標(biāo)記，結(jié)合DNA芯片技術(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的篩查和分析。近年來(lái)，新型SNP分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了關(guān)聯(lián)分析在禾谷類作物，特別是玉米遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用。

2 基于SNP分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

2.1 關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)——連鎖不平衡 （Linkage disequilibrium，LD）

LD指的是同一條染色體上2個(gè)等位基因間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)，即當(dāng)位于同一條染色體上不同座位的2個(gè)等位基因 （A，B）同時(shí)存在的概率大于因隨機(jī)分布使2個(gè)等位基因同時(shí)出現(xiàn)的概率時(shí)，就稱這2個(gè)座位處于LD狀態(tài)，包括2個(gè)標(biāo)記間或2個(gè)基因／QTL間或1個(gè)基因／QTL與1個(gè)標(biāo)記座位間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)［7］。LD的度量一般不直接使用D值進(jìn)行衡量，而是用LD系數(shù)r2和D’估計(jì)2個(gè)位點(diǎn)之間的LD水平。假設(shè)有2個(gè)連鎖的位點(diǎn)A （等位基因?yàn)锳、a）和B（等位基因?yàn)锽、b），各自的基因頻率分別為PA、Pa、PB、Pb，它們組成的單倍型有AB、Ab、aB、ab 4種，各自的基因型頻率分別為PAB、PAb、PaB、Pab，實(shí)際觀察到的單倍型頻率與期望頻率之間的差異D的計(jì)算公式為:D＝ （PAB－PAPB）。LD系數(shù)D’＝D2／min （PAPb，PaPB）（D＜0）或D’＝D2／min （PAPB，PaPb）（D＞0），D’是與頻率無(wú)關(guān)的量，當(dāng)D’＝1時(shí)，說(shuō)明兩位點(diǎn)間沒(méi)有發(fā)生重組；D’＝0時(shí)，稱為無(wú)LD或連鎖平衡，即4種單倍頻率相等。D’＜1，說(shuō)明兩位點(diǎn)間發(fā)生過(guò)重組或突變，4種單倍型均可出現(xiàn)。LD系數(shù)r2＝D2／PAPaPBPb，r2是與頻率有關(guān)的量，r2＝1時(shí)，說(shuō)明兩位點(diǎn)無(wú)重組，稱為完美LD，即觀察到一個(gè)標(biāo)記就可得到另一個(gè)標(biāo)記的全部信息。r2＝0時(shí)，稱為無(wú)LD或連鎖平衡，即4種單倍頻率相等。r2＞0.33時(shí)，表示有較強(qiáng)的LD。D’反映位點(diǎn)間的重組史，r2反映不僅反映重組史，也包括了突變史。相比D’，r2可以提供標(biāo)記是否能與QTL相關(guān)的信息，因此在關(guān)聯(lián)分析中通常使用r2來(lái)表示群體的LD水平。連鎖（linkage）與連鎖不平衡是相關(guān)但不相同的2個(gè)概念，連鎖指的是同一條染色體上非等位基因的聯(lián)合傳遞，而連鎖不平衡指的是群體內(nèi)等位基因之間的相關(guān)關(guān)系。

LD受多種因素影響，如物種的交配模式、群體大小、群體結(jié)構(gòu)、染色體的位置、突變和重組等。水稻、小麥、擬南芥等自交物種中，由于純合度高，不同基因間的重組率低，即使在很長(zhǎng)的物理距離內(nèi)（可達(dá)幾百bp）也存在LD。例如自交物種擬南芥，其LD的衰減要比玉米慢得多。對(duì)擬南芥的研究表明，其LD衰減距離可達(dá)1cM，而異交作物如玉米等，由于基因間重組程度與頻率較高，其LD衰減迅速［8］。群體內(nèi)的遺傳多樣性也是影響LD的重要因素，如在玉米中，地方品種在600bp范圍內(nèi)存在LD衰減，而對(duì)玉米自交系來(lái)說(shuō)，由于連續(xù)自交導(dǎo)致不同座位基因間的純合程度大大提高，LD衰減較遺傳多樣性豐富的地方品種大大降低，遺傳多樣性較為豐富的玉米自交系在1500bp范圍內(nèi)存在LD衰減，而少數(shù)骨干自交系往往在100000bp內(nèi)都可能存在LD［9－11］。

2.2 關(guān)聯(lián)分析的方法

關(guān)聯(lián)分析或LD作圖主要包括2種方法，分別是基于全基因組和基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析。全基因組掃描方法 （genomewide association study，GWAS）采用一定數(shù)量的分布于基因組中的分子標(biāo)記對(duì)所選材料進(jìn)行基因型鑒定，一般不涉及候選基因的預(yù)測(cè)，而基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析是在基于目標(biāo)候選基因的序列水平上，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析的方法發(fā)掘與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。Wilson等［12］對(duì)玉米籽粒淀粉合成有關(guān)的6個(gè)候選基因ae1、bt2、sh1、sh2、su1、wx1與玉米子粒組分進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，bt2、sh1、sh2基因與玉米籽粒組分存在顯著關(guān)聯(lián)，ae1與sh2基因與淀粉糊化特性顯著關(guān)聯(lián)，ae1與sh1基因與直鏈淀粉水平存在顯著關(guān)聯(lián)。Andersen等［13］對(duì)催化玉米中木質(zhì)素生物合成代謝的酶基因PAL進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在考慮和不考慮群體結(jié)構(gòu)的2種情況下，均發(fā)現(xiàn)了基因中與這些自交系的飼用品質(zhì)存在顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)性。而在全基因組關(guān)聯(lián)分析方面，Beló等［14］等用8590個(gè)SNP對(duì)553個(gè)原始玉米材料進(jìn)行了油酸含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析，首次運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析證實(shí)了與控制油酸合成相關(guān)的fad2基因，并將該基因定位到與已知分子標(biāo)記相距2kb的精度。

兩種關(guān)聯(lián)分析方法各有特點(diǎn)，其作圖精度均取決于作圖群體的大小與作圖群體的LD程度。基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析方法則適用于LD程度相對(duì)較低的作圖群體，該方法獲得的物種遺傳信息相對(duì)較少，但它可以有效減少基因型檢測(cè)的數(shù)量，同時(shí)容易對(duì)目標(biāo)QTL進(jìn)行精細(xì)定位，是鑒定候選基因功能的有效方法；而全基因組掃描法適用于在很長(zhǎng)物理距離內(nèi)都存在LD的作圖群體，容易獲得較多的遺傳信息，可以發(fā)掘基因組中大量與數(shù)量性狀相關(guān)的位點(diǎn)，但該方法需要數(shù)量龐大的SNP標(biāo)記和無(wú)群體結(jié)構(gòu)的大規(guī)模作圖群體，工作量龐大，不易完成。但隨著主要物種測(cè)序工作的相繼完成，大量SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，全基因組關(guān)聯(lián)分析將在未來(lái)玉米基因組學(xué)研究中發(fā)揮重要的作用。

2.3 影響關(guān)聯(lián)分析的因素

關(guān)聯(lián)分析在物種數(shù)量性狀研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，但也受到多方面因素的影響，可能產(chǎn)生表型與基因型間的假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)。影響LD的因素都會(huì)對(duì)關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果產(chǎn)生影響，首要因素就是作物的群體結(jié)構(gòu)。許多重要作物都擁有漫長(zhǎng)的馴化史，復(fù)雜的選育過(guò)程以及來(lái)自野生近緣種的遺傳漂變，造成了種質(zhì)資源內(nèi)存在著復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)［15］。當(dāng)研究所使用的群體存在較多亞群時(shí)，等位基因在基因組上的分布往往不平衡，可能造成標(biāo)記與數(shù)量性狀相關(guān)位點(diǎn)的假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，從而使關(guān)聯(lián)分析更加復(fù)雜［16］。解決假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的辦法就是使用盡可能多的覆蓋全基因組的分子標(biāo)記和采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法，SNP分子標(biāo)記技術(shù)因其覆蓋范圍廣、數(shù)量眾多的特點(diǎn)，成為進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的理想分子標(biāo)記技術(shù)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面，目前也已發(fā)展出了多種可控制群體結(jié)構(gòu)影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以解決假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的問(wèn)題［17］。此外，對(duì)于遺傳多樣性較低的物種，基因多態(tài)性的降低往往造成LD作圖中統(tǒng)計(jì)能力的下降，在這種情況下連鎖分析往往比LD作圖更具優(yōu)越性。為了克服2種作圖方法的各自缺陷，目前已發(fā)展出基于連鎖作圖和連鎖不平衡作圖的整合作圖法，整合作圖法結(jié)合了2種類型的作圖群體，使得作圖群體進(jìn)一步增大，作圖效率也比單一作圖法有所增加，有望進(jìn)一步提高QTL定位的精度［18］。

2.4 關(guān)聯(lián)分析在作物育種工作中的應(yīng)用

數(shù)量性狀基因的定位、克隆的最終目的都是為分子標(biāo)記輔助育種工作進(jìn)行服務(wù)，利用分子標(biāo)記技術(shù)選擇優(yōu)良的品系或品種，而基于SNP的關(guān)聯(lián)分析有望在該領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用，主要體現(xiàn)在以下2個(gè)方面:（1）數(shù)量性狀基因的深度挖掘和精確定位。基于SNP的關(guān)聯(lián)分析能夠大大提高作圖精度，結(jié)合連鎖分析進(jìn)行整合作圖可以使QTL定位達(dá)到單基因水平，可以顯著提高與分子標(biāo)記緊密連鎖的的目標(biāo)性狀的選擇效率，從而整體推進(jìn)育種工作的速度與精度，這也是分子標(biāo)記育種的最終目的。（2）推動(dòng)功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。功能標(biāo)記是指從影響性狀變異基因的功能域開(kāi)發(fā)出來(lái)的多態(tài)性標(biāo)記，其序列信息已完全獲得，而該基因與目標(biāo)性狀是否相關(guān)就可以通過(guò)基于LD的關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行驗(yàn)證；在此基礎(chǔ)上就可以針對(duì)其特定序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的等位基因PCR引物，進(jìn)行相關(guān)標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，并在遺傳基礎(chǔ)廣泛的種質(zhì)資源中繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證，以用于廣泛遺傳背景下的分子標(biāo)記輔助育種，從而提高優(yōu)良品系或品種的選擇效率。

3 展望

近年來(lái)，關(guān)聯(lián)分析在植物數(shù)量性狀的研究中的作用越來(lái)越重要，并伴隨分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、基因組學(xué)、新型統(tǒng)計(jì)模型的發(fā)展而不斷改進(jìn)和完善。隨著玉米基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，利用關(guān)聯(lián)分析挖掘新基因、開(kāi)發(fā)新標(biāo)記、定位新性狀將日益成為玉米種質(zhì)資源研究的重要手段與方法。隨著關(guān)聯(lián)分析在玉米種質(zhì)資源研究中的廣泛應(yīng)用，玉米中控制各種重要農(nóng)藝性狀的優(yōu)異等位基因的發(fā)掘和利用的速度、精度將顯著提高，這將有利于推動(dòng)我國(guó)玉米種質(zhì)資源的遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新，并最終實(shí)現(xiàn)為育種實(shí)踐服務(wù)的目標(biāo)。

［1］方宣均，吳為人，唐紀(jì)良.作物DNA標(biāo)記輔助育種 ［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［2］Flint－Garcia S A，Thuillet A C，Yu J M，et al.Maize association population:a high－resolution platform for quantitative trait locus dissection ［J］.Plant J，2005，44:1054－1064.

［3］Myles S，Peiffer J，Brown P J，et al.Association mapping:critical considerations shift from genotyping to experimental design ［J］.The Plant Cell，2009，21:2194－2202.

［4］Yang X H，Yan J B，Zhang Y P，et al.Reviews of association analysis for quantitative traits in plant［J］.Acta agronomica sinica，2007，33:523－530.

［5］Thornsberry J M，Goodman M M，Buckler E S，et al.Dwarf8polymor－phisms associate with variation in flowering time ［J］.Nature Genetics，2001，28:286－289.

［6］Wright S I，Vroh B I，Schroeder S G，et al.The effects of artificial selection on the maize genome［J］.Science，2005，308:1310－1314.

［7］Gupta P K，Rustgi S，Kulwal P L.Linkage disequilibrium and association studies in higher plants:Present ststus and future prospects ［J］.Plant Mol Biol，2005，57:461－485.

［8］Nordborg M，Borevitz J O，Bergelson J，et al.The extent of linkage disequilibrium in Arabidopsis thaliana ［J］.Nat Genet，2002，30:190－193.

［9］Remington D L，Thornsberry J M，Matsuoka Y，et al.Structure of linkage disequilibrium and phenotypic association in the maize genome ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:156－158.

［10］Tenaillon M I，Sawkins M C，Long A D，et al.Patterns of DNA sequence polymorphism along chromosome 1of maize（Zea mays ssp.way L）［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:58－60.

［11］王榮煥，王天宇，黎裕.植物基因組中的連鎖不平衡 ［J］.遺傳，2007，29（11）:1317－1323.

［12］Wilson L M，Whitt，S R，Ibanez A M，et a1.Dissection ofmaize kernel composition and starch production by candidate gene association ［J］.Plant Cell，2004，16:2719.

［13］Andersen J R，Schrag T，Melchinger A E.Validation of Dwarf8polymorphisms associated with flowering time in elite European inbred lines of maize ［J］.Theor Appl Genet，2005，111:206－217.

［14］BelóA，Zheng P，Luck S.Whole genome scan detects an allelic variant of fad2associated with increased oleic acid levels in maize［J］.Mol Genet Genomics，2008，279:1－10.

［15］Sharbel T F，Haubold B，Mitchell T.Genetic isolation by distance in Arabidopsis thaliana:biogeography and postglacial colonization of Europe ［J］.Mol Ecol 2000，9:2109－2118.

［16］Knowler W C，Williams R C，Pettitt D J，et al.Gm3；5，13，14and type 2diabetes mellitus:an association in American Indians with genetic admixture［J］.Am J Hum Genet，1988，43:520－526.

［17］Yu J M，Pressoir G，Briggs W H，et al.An unified mixed－model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness［J］.Nat Genet，2006，38:203－208.

［18］盧艷麗.不同類型玉米種質(zhì)分子特征分析及耐旱相關(guān)性狀的連鎖－連鎖不平衡聯(lián)合作圖 ［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.