李 文，陳復(fù)生*，丁長河，李盤欣

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南南街村集團有限公司技術(shù)中心，河南 漯河 462699）

0 引言

堿性蛋白酶是一類最適pH 值偏堿性、適用于在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶，是一類非常重要的工業(yè)用酶，因其具有較強的水解能力、耐堿和耐熱能力，在食品、洗滌劑和絲綢、皮革制造業(yè)等中都發(fā)揮了巨大作用[1-3].大部分堿性蛋白酶的最適pH 值為9～11，少數(shù)蛋白酶的最適pH 值更高，如克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）GMBE 22所產(chǎn)蛋白酶的最適pH 值為12[4].堿性蛋白酶的最適溫度范圍較廣，由黃海底泥分離得到一株能夠穩(wěn)定高產(chǎn)蛋白酶菌株HW08，所產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的最適作用溫度為30 ℃[5]，而分離自嗜堿芽孢桿菌（Bacillus sp）B18 所產(chǎn)蛋白酶最適溫度可以達到85 ℃[6].同時研究表明一些金屬離子對堿性蛋白酶的活力有促進或抑制的作用，在對地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）彈性蛋白酶的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度金屬離子Ca2+和K+對其酶活力有促進作用，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+對其酶活力具有抑制作用[7].本實驗室前期篩選了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，經(jīng)鑒定為高地芽孢桿菌PY41[8]，并進行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.在前期研究的基礎(chǔ)上，對高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶進行了分離與純化，通過SDS-PAGE 凝膠電泳驗證，得出該堿性蛋白酶的相對分子質(zhì)量為29 500.而對該菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶性質(zhì)的研究在國內(nèi)外尚未見報道，故作者對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，為其在食品及其他行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：高地芽孢桿菌PY41，本實驗室自篩菌株.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：豆粕60、磷酸銨12、葡萄糖15、乳 糖 40、KCl 0.3、CaCl20.7、MgSO4·7H2O 0.2、pH 10[8].

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C 型pH 計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；TGL-16G 型臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7504 型紫外-可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

采用Folin-酚法[9].取1 mL 酶液40 ℃預(yù)熱2 min，加入預(yù)熱5 min 的1 mL 1%酪蛋白溶液中，在40 ℃水浴中反應(yīng)10 min.再加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，在40 ℃水浴中反應(yīng)10 min，7 000 r/min離心10 min，取上清液.加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3中，再加入1.00 mL Folin 試劑混合均勻，在40 ℃水浴中顯色20 min.空白對照中加入酪蛋白和三氯乙酸的順序不同，其他相同.在680 nm 下測定吸光度值并計算酶活.

1.3.2 堿性蛋白酶最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性的研究

配制0.5 mol/L 的pH 4～6 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 7、pH 8、pH 8.5 的Tris-HCl 緩沖液，pH 9、pH 9.5、pH 10 的Gly-NaOH 緩沖液，pH 11、pH 12 的Na2HPO4-NaOH 緩沖液.用緩沖液分別稀釋純化后的酶液至一定倍數(shù)，并用該緩沖液配制1 %的酪蛋白溶液.在50 ℃條件下，測定不同pH值的堿性蛋白酶活力.同時將不同pH 值的酶液在50 ℃恒溫水浴下保溫30 min，測定堿性蛋白酶活力.

1.3.3 堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的研究

在pH 9.5 的條件下，測定堿性蛋白酶在20℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃恒溫水浴下的酶活力.同時將該酶液分別置于40℃、50 ℃、60 ℃恒溫水浴下保溫1 h，測定該酶活力.

1.3.4 金屬離子、EDTA 和SDS 對堿性蛋白酶酶活力的影響

配制含有Mn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+、Na+、Zn2+金屬離子和EDTA、SDS 的緩沖液，分別用上述緩沖液稀釋酶液，至終濃度為5 mmol/L[10].按照測定堿性蛋白酶酶活的方法測定酶活，以不加入上述緩沖液的蛋白酶酶活力為100%.

1.3.5 堿性蛋白酶動力學(xué)常數(shù)的測定[11]

配 制 濃 度 為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL，pH 為9.5 的酪蛋白溶液，取1 mL 不同濃度的酶液與稀釋到一定濃度的蛋白酶液在50 ℃時反應(yīng)10 min，用Folin 法測活力，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法，得出Km值和vmax.

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對堿性蛋白酶活力的影響

pH 值對堿性蛋白酶酶活力的影響如圖1 所示.在pH 值為5.0、6.0、12.0 時堿性蛋白酶相對酶活較低，均在15%以下.當(dāng)pH 值小于9.5 時，蛋白酶酶活力隨著pH 值的升高而升高；當(dāng)pH 值大于9.5 時，蛋白酶酶活力隨著pH 值的升高而降低.在pH 值為7.0～11.0 時，相對酶活較高，在75%以上，故該堿性蛋白酶在pH 7.0～11.0 內(nèi)仍具有較高的酶活力.在pH 值為9.5 時，酶活最高，故該堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH 值為9.5，與對黃海黃桿菌（Flavobacterium yellowsea）YS-80-122 所產(chǎn)海洋低溫堿性蛋白酶的最適pH 值一致[12].Liang 等[13]研究報道了蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）TKU 022所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH 值為10.0，李紅等[14]報道了普魯蘭短梗霉（Aureobasidium pullulans）N2-3所產(chǎn)堿性蛋白酶最適pH 值為9.0，與本試驗中堿性蛋白酶的最適pH 值相近.Chellappan S 等[15]研究報道了白色側(cè)齒霉菌（Engyodontium album）BTMFS 10 產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH 值為11，與本試驗研究的堿性蛋白酶最適pH 值相差較大.根據(jù)堿性蛋白酶的定義[16]，本試驗蛋白酶有堿性蛋白酶的特征，為堿性蛋白酶.

圖1 pH 對堿性蛋白酶的影響

2.2 pH 對堿性蛋白酶活力穩(wěn)定性的影響（圖2）

圖2 pH 對堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響

從圖2 可以看出，50 ℃水浴保溫30 min 后，蛋白酶在pH 7～11 的范圍內(nèi)的穩(wěn)定性較好，在pH 5、pH 6、pH 12 時，蛋白酶活力下降迅速.在pH 9時，蛋白酶的穩(wěn)定性最好.綜上所述，在堿性條件下，該蛋白酶的穩(wěn)定性較好，具有較寬的pH 值區(qū)間；在酸性和極端堿性條件下，蛋白酶pH 值穩(wěn)定性較差.Singh S K 等[17]報道的蠟狀芽孢桿菌SIU 1來源堿性蛋白酶和Beg Q K 等[18]報道的莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）來源堿性蛋白酶均在pH 7～11 的范圍內(nèi)穩(wěn)定，與本試驗研究的高地芽孢桿菌PY41 產(chǎn)堿性蛋白酶的pH 值穩(wěn)定范圍相同.

通過研究pH 值對高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶活力的影響，得出該酶在較寬的pH 值范圍內(nèi)（pH 7～11）表現(xiàn)出卓越的蛋白酶活力和穩(wěn)定性，這些酶性質(zhì)有利于該蛋白酶在堿性環(huán)境中和在洗滌劑中的應(yīng)用.

2.3 溫度對堿性蛋白酶活力的影響（圖3）

圖3 溫度對堿性蛋白酶的影響

從圖3 可知，在溫度小于50 ℃時，蛋白酶活力隨溫度的升高而升高；在溫度高于50 ℃時，蛋白酶活力隨溫度的升高而迅速降低；在50 ℃時，蛋白酶活力最高，為最適反應(yīng)溫度，與Annamalaia N等[19]和Abidi F 等[20]對堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度的研究結(jié)果一致.當(dāng)溫度小于40 ℃時，蛋白酶活力均在70%以下，且隨著溫度的下降，堿性蛋白酶的酶活力亦下降顯著；在60 ℃時，酶活力則下降至30%左右；在40～55 ℃范圍內(nèi)，蛋白酶的酶活力較高，均在70%以上，故在實際應(yīng)用中應(yīng)選擇此溫度范圍.

2.4 溫度對堿性蛋白酶活力穩(wěn)定性的影響（圖4）

圖4 溫度對堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響

從圖4 可知.在40 ℃時，蛋白酶活力穩(wěn)定性較好，保持在80%以上；在50 ℃時，蛋白酶活力下降至60 %左右；60 ℃水浴20 min 后，該堿性蛋白酶活力就下降至40 %左右，當(dāng)水浴60 min 時，該堿性蛋白酶酶活力則嚴重下降至10%左右，影響其在實際中的應(yīng)用.可以得出蛋白酶在小于50 ℃時穩(wěn)定性較好，在大于60 ℃時穩(wěn)定性較差.故該蛋白酶同其他堿性蛋白酶一樣，耐熱性不強.Bidochka M J 等[21]研究得出白僵菌（Beauveria bassiana）所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度范圍為37～42 ℃，在40 ℃水浴保溫30 min 后，酶活力損失近40%，本試驗純化的堿性蛋白酶溫度穩(wěn)定性與該蛋白酶酶相比，穩(wěn)定性相對較好.

結(jié)合溫度對堿性蛋白酶的影響結(jié)果，在40～55℃蛋白酶酶活力較高，在40～50 ℃不僅酶的穩(wěn)定性較好，同時還可使酶活力保持在一個較高的水平.

2.5 金屬離子、EDTA、SDS 對堿性蛋白酶活力的影響（圖5）

圖5 金屬離子、EDTA、SDS 對堿性蛋白酶酶活力的影響

有研究發(fā)現(xiàn)微生物堿性蛋白酶的來源不同，金屬離子對蛋白酶的影響也不同[22].從圖5 可以看出，Mg2+、Fe2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Na+、SDS 對蛋白酶的酶活力基本沒有影響，Ag+、Hg2+、EDTA、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+對蛋白酶均具有抑制作用，且Ag+和Hg2+對蛋白酶的抑制作用非常顯著，蛋白酶酶活降低了約90%，說明該蛋白酶活性中心的氨基酸殘基含有巰基[23].Ba2+、Ca2+、Mn2+對蛋白酶酶活具有激活作用，與金屬離子對芽孢桿菌（Bacillus sp）B001 產(chǎn)蛋白酶的影響結(jié)果相似[24].其中Mn2+對蛋白酶酶活具有明顯的激活作用，使蛋白酶活力提高了近18%，表明這些金屬離子能幫助維持蛋白酶催化活性中心的構(gòu)象.該酶對EDTA 較為敏感，所以此酶可能為金屬離子蛋白酶[25].不同金屬離子對蛋白酶活力的抑制作用由強到弱依次為Ag+、Hg2+、EDTA、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、SDS、Na+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+.

2.6 堿性蛋白酶動力學(xué)參數(shù)

Km值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，Km值的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)，Km值越小表明酶與底物的親和力越大.根據(jù)Lineweaver-Burk 法測得的酶動力學(xué)常數(shù)如圖6 所示，計算出該堿性蛋白酶的Km值為15.5 mg/mL，vmax為24.57 μg/（min·mL）.

圖6 Lineweaver-Burk 法測酶的Km值和vmax值

研究表明，有些蛋白酶的Km值較小，如Gupta A 等[23]研究的堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時的Km值為2.0 mg/mL；地衣芽孢桿菌JF-U N122 所產(chǎn)堿性蛋白酶，以酪蛋白為底物時的Km值為5.26 μg/mL[11].而有些堿性蛋白酶的Km值較大，某菌株產(chǎn)堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時的Km值為11 mg/mL[26]；嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile）所產(chǎn)蛋白酶以酪蛋白為底物時的Km值為17.6 mg/mL[27].本試驗純化的堿性蛋白酶以酪蛋白為底物時的Km值較大，與酪蛋白的親和力不高，故需在較高的酪蛋白底物濃度下進行酶解反應(yīng).

3 結(jié)論

蛋白酶在工業(yè)用酶中占據(jù)較大的比重，其中堿性蛋白酶因其獨特的水解特性，成為蛋白酶研究中的熱點.而尋找具有獨特結(jié)構(gòu)和功能，能夠適應(yīng)特別生產(chǎn)要求的新型堿性蛋白酶，具有重要的研究意義.高地芽孢桿菌為2006 年發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌新種，國內(nèi)外對其研究較少，所以對高地芽孢桿菌的研究具有巨大的潛力.本文對高地芽孢桿菌所產(chǎn)堿性蛋白酶的性質(zhì)進行了研究，表明該蛋白酶的最適反應(yīng)pH 值為9.5，在較寬的pH 值范圍內(nèi)仍具有較高的酶活力，在pH 7～9 范圍仍具有較好的穩(wěn)定性.該堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，在40～55 ℃蛋白酶酶活力較高，在40～50 ℃不僅酶的穩(wěn)定性較好，同時還可使酶活力保持在一個較高的水平.5 mmol/L 的Ag+和Hg2+對蛋白酶的抑制作用非常顯著，蛋白酶酶活降低了約90%，5 mmol/L 的Mn2+對蛋白酶酶活具有明顯的激活作用，使蛋白酶酶活力提高了近18%，而SDS 對該堿性蛋白酶的酶活基本沒有影響.該堿性蛋白酶的Km值為15.5 mg/mL，vmax為24.57 μg/（min·mL），其Km值較大，與底物的親和力較小，即在較高的底物濃度下，才能達到較好的酶解效果.

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