馬志剛,鄭永雯,馮益青,王沛霖,楊保濤,邵婭婷,劉彥雄,曹秋娥

(云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

鬼臼毒素是八角蓮、桃兒七、山荷葉等小檗科多年生草本類群鬼臼亞科屬植物中的重要活性成分,具有抗腫瘤、抗癌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用等功能,尤其是在抗癌方面發(fā)揮了重要的作用[1-4].4′-去甲鬼臼毒素是鬼臼毒素衍生物之一,既具有抗癌活性且毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),也是重要的抗癌藥物如VP-16和VM-26結(jié)構(gòu)改造的前體.因此對鬼臼毒素類物質(zhì)的研究包括對其含量的測定引起了廣泛的關(guān)注.

目前,測定鬼臼毒素含量的方法主要有光度法[5]、熒光法[6]、高效毛細(xì)管電泳[7]和高效液相色譜法[8-12].這些已有的報(bào)道方法各有其不同的特點(diǎn),但都沒有涉及鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的同時(shí)分離測定.用反相高效液相色譜法,建立了一個(gè)同時(shí)分離測定鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的方法,并以此方法對八角蓮不同部位中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量進(jìn)行了研究,結(jié)果在八角蓮的葉、莖、須和根中都沒有檢測到4′-去甲鬼臼毒素,但都檢測到了鬼臼毒素,而且發(fā)現(xiàn),鬼臼毒素的含量在根部最多,而在葉中的含量最少.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters1525-HPLC色譜儀帶，Waters2996 PAD二極管陣列檢測器，Waters717plus Autosampler自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower中文色譜工作站.

標(biāo)準(zhǔn)對照品鬼臼毒素(PPT)和4′-去甲鬼臼毒素(DMEP)均為Sigma公司產(chǎn)品.八角蓮樣品采自云南省玉溪地區(qū)野生珍稀植物栽培區(qū).色譜分析用溶劑為色譜純,其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 對照品溶液配制

儲(chǔ)備液鬼臼毒素(1.500 mg/mL)和4′-去甲鬼臼毒素(1.000 mg/mL)分別用乙醇配制，4℃下保存.各對照品工作溶液由儲(chǔ)備液用乙醇稀釋得到.

1.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取八角蓮的葉、莖、須和根各 1.000 0 g，均用50 mL無水乙醇于80 ℃回流提取8 h后，再超聲提取30 min，過濾.濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.06 MPa下減壓濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解并定容至10 mL，得樣品溶液.所有樣品溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣分析.

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters Spherisorb ODS2 5 μm(4.6 mm i.d.×250 mm)；流動(dòng)相:甲醇-水混合溶劑(65∶35，V/V)；流速:1.0 mL/min；柱溫:40 ℃；檢測波長:207 nm；進(jìn)樣量:20μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化選擇

流動(dòng)相的組成影響分析的靈敏度、峰的分離度以及分析時(shí)間.考察了流動(dòng)相中甲醇含量變化對4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖1.可見，4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留時(shí)間均隨流動(dòng)相中甲醇含量的增大而減小，而兩組分的分離度卻隨甲醇含量的增大先降低后有所增加.為兼顧分離度和分析時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選用了體積比為65∶35的甲醇-水混合溶液作為流動(dòng)相.

2.2 色譜圖

按上述優(yōu)化的色譜條件得到的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2.

2.3 方法的線性關(guān)系

取乙醇儲(chǔ)備液稀釋后的的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素對照品混合物平行進(jìn)樣6次,記錄色譜峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,線性范圍和回歸方程見表1.

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液,分別連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算2個(gè)組分的保留時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1.

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取八角蓮的莖6份,按樣品溶液的制備方法制備成6份,分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積,計(jì)算含量,結(jié)果鬼臼毒素含量的RSD為3.50%，表明方法重現(xiàn)性良好.

2.6 回收率試驗(yàn)

在各樣品提取液中分別加入一定量的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素對照品,用0.45 μm微孔濾膜過濾后,濾液分別進(jìn)樣20 μL,進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2.

2.7 樣品測定

采用上述HPLC方法分析八角蓮葉、莖、須和根中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量,結(jié)果見表2.樣品的色譜圖見圖3.

表1 工作曲線與精密度(n=6)

表2 八角蓮不同部位鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的測定結(jié)果 (n=6)

注：表中“—”表示未檢出.

3 結(jié)語

采用甲醇-水為流動(dòng)相,反相色譜分離模式分離和測定八角蓮中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量.測定結(jié)果表明，八角蓮根、莖、葉和須的乙醇提取物中均未檢測到4′-去甲鬼臼毒素，而鬼臼毒素在八角蓮的葉、莖、須和根中的分布是不一樣的,其中在根部的含量最高，而在葉中的含量則最低,這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果是一致的[7].

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