唐耿鐵， 王 平， 洪言情， 辛淑麗， 王 強(qiáng)， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

絲素蛋白具有良好的物理機(jī)械性能、生物相容性及可降解性，以絲素蛋白為原料可制備生物醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域中需要的凝膠、絲素膜及微膠囊材料[1-3]。為提高絲素蛋白材料的應(yīng)用性能，不同的絲素蛋白改性方法得到應(yīng)用：包括對側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，與其他高分子共混，或通過分子工程改性加工等[4-6]。而生物酶法具有高效、專一和生態(tài)環(huán)保的優(yōu)勢，并在高分子材料加工中得到廣泛應(yīng)用。絲素蛋白中含有約10%的酪氨酸殘基[7]，可被多酚氧化酶(如酪氨酸酶)催化氧化，形成多巴及反應(yīng)性強(qiáng)的多巴醌結(jié)構(gòu)衍生物[8]，繼而可與含氨基的化合物發(fā)生親核反應(yīng)，這為基于酶法的絲素蛋白改性提供了可能。本文以酪氨酸酶進(jìn)行了絲素蛋白催化氧化，考察了酶促反應(yīng)過程中絲素氧化產(chǎn)物(多巴及醌類衍生物)濃度的變化，對酶促氧化反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探究，為絲素蛋白材料生物酶法功能改性奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑蠶絲織物，90 g/m2；酪氨酸酶(845 U/mg，美國Worthington Biochemical Corporation)；無水氯化鈣，無水乙醇，乙二胺，N-N二甲基甲酰胺(DMF)等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙二胺鹽酸鹽，3-甲基-2苯并噻唑酮腙鹽酸鹽(MBTH)，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(SHIMADZU，日本)，F(xiàn)-4600熒光光度計(jì)(HITACHI，日本)，KDⅡ-0.05微機(jī)控制萬能強(qiáng)力試驗(yàn)機(jī)(深圳市凱強(qiáng)利試驗(yàn)儀器有限公司)，D8 Advance型X-射線衍射儀(Bruker AXS，德國)，SU1510掃描電子顯微鏡(HITACHI，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲素蛋白溶液制備

將脫膠的桑蠶絲織物以氯化鈣-乙醇體系(摩爾比CaCl2∶CH3CH2OH∶H2O =1∶2∶8)溶解，經(jīng)100℃處理2 h后冷卻至室溫，以去離子水透析3 d，經(jīng)離心去除雜質(zhì)后得到絲素蛋白溶液，以稱重法標(biāo)定其濃度。

1.2.2 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白反應(yīng)

在開放體系中用酪氨酸酶催化氧化1%(w/v)絲素蛋白溶液，處理?xiàng)l件：酪氨酸酶17 U/mL、30℃、pH值7.0，處理時(shí)間8 h，空白樣中添加經(jīng)失活處理的酪氨酸值酶。

1.2.3 絲素蛋白膜制備

在1.2.2條件下用酪氨酸酶處理絲素蛋白溶液(4% ，w/v)，空白樣為同濃度的純絲素蛋白溶液。將2種溶液在聚四氟乙烯模具中流延成膜，在室溫下風(fēng)干成膜，或先經(jīng)-20℃冷凍5 h，再在-50℃下真空干燥24 h后得到冷凍干燥膜。

1.3 測試與表征

1.3.1 絲素溶液紫外分光分析

用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)測定經(jīng)酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液及空白溶液在300 nm～500 nm范圍吸光度的變化。

1.3.2 絲素中多巴及多巴醌類氧化產(chǎn)物分析

多巴能與乙二胺鹽酸鹽反應(yīng)生成具有熒光性質(zhì)的縮合物，通過測定縮合物的熒光強(qiáng)度變化間接表征多巴的濃度變化。取20 μL的酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液，向其中加入70 μL乙二胺、50 μL乙二胺鹽酸鹽溶液(2 M，pH值11)和980 μL去離子水，50℃避光反應(yīng)2 h，自然冷卻后用F-4600熒光光度計(jì)掃描熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為420 nm和543 nm[9]。

多巴醌類物質(zhì)能與MBTH反應(yīng)形成粉色染料，實(shí)驗(yàn)中取480 μL酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液，980 μL DMF水溶液(4.3%，v/v)，580 μL MBTH溶液(20.7 mM)，混合均勻后在25℃反應(yīng)10 min，測定混合液在505 nm的吸光度[9]。

1.3.3 絲素蛋白游離氨基濃度

將1 mL酪氨酸酶處理后的絲素溶液加入含2 mL的0.5%(w/v)的茚三酮溶液比色管中，沸水煮20 min后冷卻15 min，再加入5 mL含0.2%(w/v) KIO3的乙醇稀釋液，混勻后用UV-1800測定569 nm處吸光度[5]。參照以不同濃度甘氨酸與茚三酮溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.7698x-0.0013，其中y為569 nm吸光度；x為甘氨酸濃度，單位為μmol/mL)，計(jì)算出酶促反應(yīng)前后絲素蛋白溶液中的氨基濃度變化。

1.3.4 強(qiáng)力測試

將絲素蛋白風(fēng)干膜剪成70 mm×5 mm的長條，使用萬能強(qiáng)力試驗(yàn)機(jī)測定絲素膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，計(jì)算斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長率，實(shí)驗(yàn)中拉伸速度20 mm/min，有效夾持長度40 mm。

1.3.5 XRD

用D8 Advance型X-射線衍射儀對絲素蛋白冷凍干燥膜進(jìn)行X射線掃描，記錄2θ=4°～40°間的衍射強(qiáng)度曲線。測試條件：銅靶CuKα(λ=0.15406 nm)、管電壓40 kV、管電流40 mA、掃描速度為4°/min。

1.3.6 SEM

對冷凍干燥的絲素膜進(jìn)行噴金處理，應(yīng)用SU1510掃描電子顯微鏡觀察絲素膜的多孔形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素蛋白中酪氨酸殘基酶催化氧化產(chǎn)物分析

圖1 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白紫外可見光譜

以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白溶液，考察300～500 nm范圍內(nèi)溶液吸光度的變化，結(jié)果見圖1。與酪氨酸酶溶液、絲素溶液及含失活酶的絲素溶液相比，圖1中酶促氧化后絲素蛋白溶液在350 nm附近有明顯的吸收峰，其原因可能與酪氨酸酶催化氧化絲素中酪氨酸殘基形成醌類物質(zhì)相關(guān)[10]。酪氨酸酶能將絲素蛋白中的酪氨酸殘基(a)氧化成多巴(b)，然后多巴在酶催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為多巴醌(c)，并與蛋白分子中氨基發(fā)生非酶參與的反應(yīng)，生成不同產(chǎn)物(d、e或f)，見圖2[8-9]。為研究酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白的反應(yīng)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中考察了酶催化反應(yīng)時(shí)間與絲素溶液體系中多巴、多巴醌衍生物氧化產(chǎn)物含量的變化。

圖2 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白機(jī)理[8-9]

(a)酪氨酸酶催化絲素

(b) L-酪氨酸

如圖3(a)所示，絲素溶液中多巴含量總體上呈先增加，后下降的趨勢。酶催化氧化絲素中的酪氨酸殘基成多巴，使體系中多巴含量增加，同時(shí)多巴轉(zhuǎn)化成醌類衍生物又使體系中多巴濃度下降。當(dāng)酶處理時(shí)間超過120 min后，體系中多巴產(chǎn)物的新增速率下降，更多多巴轉(zhuǎn)化成醌類衍生物；隨著反應(yīng)時(shí)間延長，圖2中第3步非酶反應(yīng)產(chǎn)物的濃度增加，其中具有醌類結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物d使得多巴醌衍生物表觀含量增大，具有類多巴結(jié)構(gòu)的還原產(chǎn)物二酚化合物f使體系中測得的多巴表觀濃度略有增加。圖3(b)采用L-酪氨酸為模型物，對上述酶促絲素蛋白氧化及交聯(lián)機(jī)制進(jìn)行了對照分析，多巴濃度亦呈先增加后減小再增加的趨勢，多巴醌衍生物濃度達(dá)到峰值后持續(xù)下降，其原因可能是多巴醌在系列非酶反應(yīng)中被還原成類多巴二酚結(jié)構(gòu)(如5,6-二羥基吲哚)[11]。

2.2 酪氨酸酶催化氧化對絲素蛋白中游離氨基數(shù)的影響

絲素蛋白在酪氨酸酶催化氧化過程中生成的多巴醌能與氨基、巰基等親核性基團(tuán)發(fā)生非酶促反應(yīng)，促進(jìn)絲素蛋白分子自交聯(lián)[7]。絲素蛋白含一定量的氨基，通過測定酶催化體系中剩余氨基含量變化，可從一定程度上評價(jià)酶催化反應(yīng)中絲素蛋白分子自交聯(lián)情況。圖4考察了不同酶處理時(shí)間對體系中游離氨基含量的影響，結(jié)果表明隨著處理時(shí)間延長，絲素蛋白溶液中游離氨基數(shù)逐漸減少，并且在480 min后漸趨緩和，表明在非酶反應(yīng)中生成的多巴醌與絲素上伯胺基發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)了絲素蛋白分子間的交聯(lián)。

圖4 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白體系中氨基含量變化

圖5 酪氨酸酶處理對絲素風(fēng)干膜斷裂強(qiáng)度及斷裂伸長率影響

2.3 酪氨酸酶催化氧化對絲素蛋白膜強(qiáng)力的影響

將酶催化的絲素蛋白溶液鑄膜并室溫風(fēng)干，通過強(qiáng)力測試分析酪氨酸酶催化對絲素蛋白室溫風(fēng)干膜機(jī)械性能的影響，結(jié)果見圖5。與未經(jīng)酪氨酸酶處理的空白樣相比，經(jīng)酪氨酸酶處理后絲素膜斷裂強(qiáng)度增加，斷裂伸長率下降較明顯，表明酪氨酸酶處理促進(jìn)了絲素蛋白分子間的交聯(lián)，提高了膜材料的力學(xué)性能。

2.4 XRD

為考察酪氨酸酶催化氧化對絲素蛋白分子二級結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)中以酶處理后的絲素溶液制備冷凍干燥膜，并進(jìn)行膜材料XRD測試，結(jié)果見圖6。絲素蛋白在11.8°，22.0°處的衍射峰由ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)引起，在16.5°，20.2°，24.9°，30.90°，34.59°，40.97°和44.12°處的衍射峰由β-折疊結(jié)構(gòu)(SilkⅡ)引起[12]。從圖中可知，純絲素蛋白膜(1)在2θ=10°～12°有較弱的衍射峰，在2θ=20°～27°有較寬而強(qiáng)的衍射峰，說明純絲素蛋白的冷凍干燥膜中ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(SilkⅠ)、β-折疊結(jié)構(gòu)(SilkⅡ)并存，SilkⅡ的產(chǎn)生可能是由于冷凍過程中冰晶的剪切力引起的[13-14]。經(jīng)酪氨酸酶處理后制得的絲素蛋白膜在2θ=22°～24°有相對較窄的衍射峰，其二級結(jié)構(gòu)更趨于SilkⅠ結(jié)構(gòu)，說明酪氨酸酶的對絲素蛋白的催化氧化引起了絲素蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 冷凍干燥絲素膜的XRD曲線

圖7 冷凍干燥絲素膜的SEM圖

2.5 SEM

圖7顯示了經(jīng)過不同處理絲素溶液制成的冷凍干燥膜的SEM圖。純絲素蛋白膜和經(jīng)酶促氧化反應(yīng)制得的絲素膜都呈現(xiàn)了多孔的結(jié)構(gòu)，但純絲素蛋白的冷凍干燥膜的孔徑大而不規(guī)則，而經(jīng)酪氨酸酶處理的絲素蛋白冷凍干燥膜孔徑較為規(guī)則，表明酪氨酸酶對絲素蛋白催化氧化可能影響其在冷凍干燥過程中的孔隙結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

酪氨酸酶能將絲素蛋白中酪氨酸殘基先后氧化成多巴及多巴醌，反應(yīng)中多巴含量總體呈先增大后減小的趨勢，非酶反應(yīng)中多巴醌能與絲素蛋白中伯胺基反應(yīng)，使體系中醌類衍生物表觀含量明顯增加，類多巴二酚結(jié)構(gòu)產(chǎn)物略有增多。

絲素蛋白上的氨基與多巴醌的反應(yīng)促進(jìn)了絲素蛋白的自交聯(lián)，表現(xiàn)為絲素蛋白經(jīng)酪氨酸酶處理后，溶液中游離氨基數(shù)下降，制得的絲素室溫風(fēng)干膜的斷裂強(qiáng)度增加，斷裂伸長率下降。

以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白，制得的冷凍干燥膜中蛋白二級結(jié)構(gòu)以SilkⅠ為主，膜多孔形態(tài)結(jié)構(gòu)可能受酶催化氧化影響。

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