楊軍政 綜述，李永海，李 萌，林俊堂 審校

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院干細(xì)胞與生物治療技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

自2000年Erices等[1]報(bào)道臍帶血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞以來(lái)，因臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，免疫調(diào)節(jié)作用和無(wú)倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者的關(guān)注。隨后，有學(xué)者分別報(bào)道了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[2-3]。目前人們已經(jīng)可以成功地體外分離培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，并且對(duì)其生物學(xué)特性、表面標(biāo)志和免疫原性有了進(jìn)一步的了解。近年來(lái)成功地誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、脂肪、軟骨、肝臟及神經(jīng)等成體細(xì)胞，展示了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)限分化潛能和廣闊的應(yīng)用前景。從而為體外誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化各種成體細(xì)胞和各種疾病的治療提供了新的思路。

1 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及誘導(dǎo)分化

1.1臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離主要有以下幾種方法[4]：密度梯度離心法、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞分離法和免疫磁珠法等。目前采用最多的是密度梯度離心法，但分離的純度不高。流式細(xì)胞分離法和免疫磁珠法都是通過(guò)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，分離的細(xì)胞純度較高，但成本較高。

目前在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方面沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。常用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、DMEM、IMEM和MesencultTM等，在培養(yǎng)基中添加胎牛血清或者生長(zhǎng)因子的含量和種類也不盡一致，傳代培養(yǎng)的方案也不完全相同。由于胎牛血清的成分的復(fù)雜性和對(duì)結(jié)果的不可預(yù)知性，目前在干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，大多采用低血清甚至是無(wú)血清的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)方法的進(jìn)一步成熟有望統(tǒng)一干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，也為干細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多潛能干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的生命力，并且在體外一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為各種神經(jīng)樣細(xì)胞。近年來(lái)利用臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究比較多。目前常用的誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)方法包括以下幾種:(1)生長(zhǎng)因子類，包括bFGF、EGF、BNGF和RA等；(2)抗氧化劑類，包括DMSO、β-巰基乙醇、黃芪苷、丹參提取物、枸杞多糖等；(3)基因轉(zhuǎn)染，通過(guò)一些基因諸如Noggin、Notch等在臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)來(lái)獲得神經(jīng)樣細(xì)胞；(4)細(xì)胞共培養(yǎng)，即采用與神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者其他類神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，通過(guò)細(xì)胞之間分泌的有關(guān)生長(zhǎng)或者營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞信號(hào)等來(lái)誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。

有學(xué)者分別報(bào)道了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物以來(lái)[2-3]，許多學(xué)者采用不同的誘導(dǎo)方法都成功地誘導(dǎo)獲得了神經(jīng)樣細(xì)胞。如Arien-Zakay等[5]采用IFN-gamma誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)IFN-gamma可以提高臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化，并且可以增強(qiáng)β-tubulin、MAP-2、NF-M、NSE等神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)。而Li等[6]采用10 μmol/L全反式維甲酸誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞12 d后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，并且表達(dá)TH和DAT多巴胺神經(jīng)標(biāo)志物。Slovinska等[7]采用磁珠細(xì)胞分選法獲得CD133+和CD133-兩種細(xì)胞，采用EGF和bFGF誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)兩者都可以誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物，并且CD133+細(xì)胞表達(dá)MAP2、RIP和S100的陽(yáng)性率要比CD133-細(xì)胞高。

而Yang等[8]采用細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，通過(guò)羊膜上皮細(xì)胞分泌的多效生長(zhǎng)因子刺激臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，從而獲得多巴胺神經(jīng)元。Devarajan等[9]采用腺病毒作為載體通過(guò)表達(dá)Atoh1首次誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為聽(tīng)毛細(xì)胞樣細(xì)胞。隨后，管讓憲等[10]證明了中藥黃芩苷體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的可行性。黃仕雄等[11]則采用體外轉(zhuǎn)染的方法，用Nurr1基因修飾人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，成功分化為多巴胺神經(jīng)元。最近，Divya等[12]采用免疫熒光、熒光激活細(xì)胞篩選和PCR的方法研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存在兩種細(xì)胞群體，兩者都表達(dá)CD29和CD105，一種細(xì)胞群體具有與生俱來(lái)的神經(jīng)形成潛力，同時(shí)表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2、ABCG2等多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物和神經(jīng)外胚層標(biāo)志物nestin，在簡(jiǎn)單的刺激下可以像神經(jīng)細(xì)胞分化；而另一種細(xì)胞群體則表現(xiàn)為間充質(zhì)特性，需要多種生長(zhǎng)因子刺激下才能分化為神經(jīng)細(xì)胞。

2 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為最有潛力的多潛能干細(xì)胞之一，其來(lái)源豐富、采集方便、安全、無(wú)倫理問(wèn)題，且具有免疫調(diào)節(jié)作用等特點(diǎn)，決定了其在臨床治療方面具有很大的應(yīng)用前景。目前干細(xì)胞的臨床應(yīng)用有兩種方法：一是直接將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植體內(nèi)，通過(guò)體內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo)其為相應(yīng)的細(xì)胞，發(fā)揮相應(yīng)的作用；二是將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)其分化為目的神經(jīng)樣細(xì)胞，然后通過(guò)一定的方法植入到體內(nèi)，治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2.1在腦部損傷中的治療作用 2001年Chen等[13]在腦卒中行為缺陷的大鼠模型中，靜脈注射人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大鼠的行為缺陷行為有明顯的改善。證明臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦損傷疾病有一定的治療作用。隨后，Kim等[14]在大鼠幼鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療永久性大腦中動(dòng)脈閉塞引起的重度腦損傷也有很好的治療作用。2013年，Ahn等[15]將1×105個(gè)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞注射到腦出血的SD大鼠的側(cè)腦室部位，發(fā)現(xiàn)由腦室內(nèi)出血引起的出血性腦積水和腦損傷得到很好的改善。2010年Sun等[16]對(duì)184名兒童進(jìn)行了自體臍帶血靜脈灌注治療神經(jīng)損傷，研究發(fā)現(xiàn)，自體臍帶血靜脈灌注治療兒童神經(jīng)損傷是安全可行的(除了有3名兒童存在灌注反應(yīng)外)，從而為臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷疾病提供了直接的臨床證據(jù)。

2.2在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中的治療作用 2001年Ende等[17-18]將人臍帶血細(xì)胞注射到過(guò)表達(dá)人阿爾茲海默病淀粉樣前體蛋白的小鼠體內(nèi)和亨廷頓氏舞蹈病的小鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)這些小鼠的壽命有了明顯的延長(zhǎng)，病情得到好轉(zhuǎn)。證明了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)變性疾病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

2011年，Bigini等[19]研究發(fā)現(xiàn)，單邊腦室內(nèi)注射人臍帶血單核細(xì)胞到家族性肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥小鼠模型中可以延長(zhǎng)小鼠的壽命；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)臍帶血間充質(zhì)單核細(xì)胞存在于側(cè)腦室，可以保持4個(gè)月之久，同時(shí)分泌一些具有抗炎性的可以改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性疾病的細(xì)胞因子和趨化因子。同年，Veeravalli等[20]將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞用于顫抖性小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞可以存在并在腦內(nèi)遷移，髓鞘堿性蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，1個(gè)月后小鼠顫抖完全消失，很好的證明了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療髓鞘脫落或髓鞘形成不足等神經(jīng)性疾病中有很好的作用。最近，Seo等[21]將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞注射到發(fā)病之前的NPC小鼠的海馬組織，研究發(fā)現(xiàn)，死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量下降，運(yùn)動(dòng)缺陷有所改善。

2.3在脊髓損傷中的治療作用 Kao等[22]采用關(guān)閉壓力在55 g的動(dòng)脈鉗壓迫小鼠1 min致使小鼠脊髓損傷后，將小鼠分為椎板切除術(shù)組、椎板切除術(shù)+脊髓損傷+CD34-細(xì)胞組、椎板切除術(shù)+脊髓損傷+CD34+細(xì)胞組和椎板切除術(shù)+脊髓損傷+生理鹽水四組，CD34細(xì)胞核生理鹽水通過(guò)尾靜脈注射。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于人臍帶血的CD34+細(xì)胞通過(guò)刺激產(chǎn)生VEGF和GDNF，對(duì)脊髓損傷引起的脊髓梗塞、細(xì)胞凋亡和后肢功能異常具有很好的治療作用。而Cho等[23]首先將臍帶血祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)祖細(xì)胞，隨后移植到脊髓損傷的SD小鼠中10周后發(fā)現(xiàn)，小鼠在行動(dòng)方面有了明顯的改觀，肢體感覺(jué)誘發(fā)性電位得到回升，并且這些移植的細(xì)胞在壞死穴周圍呈現(xiàn)少突細(xì)胞表型，這些結(jié)果表明由臍帶血衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷具有一定的治療作用。2009年，Dasari等[24]在雄性大鼠脊髓損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷過(guò)程中可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。隨后，Kaner等[25]在大鼠半切脊髓損傷模型中證明臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷疾病中的治療具有很好的效果。

最近，Schira等[26]將一種從人臍帶血中分離出來(lái)的明確已知的無(wú)限制的成體干細(xì)胞移植到一只脊索嚴(yán)重?fù)p傷的免疫抑制成年大鼠的第8胸椎背部半切損傷部位附近，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體內(nèi)發(fā)生定向移動(dòng)，并在損傷部位聚集，傷口明顯變小，并且有利于軸突再生和顯著的功能性運(yùn)動(dòng)改善。

3 展 望

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多分化潛能的特性，而且來(lái)源豐富、采集方便、安全、無(wú)倫理問(wèn)題，且具有免疫調(diào)節(jié)作用，使其比胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更好的臨床應(yīng)用前景，有可能成為治療人類遺傳疾病特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞。但其中還存在著一些問(wèn)題亟待解決:(1)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性還不甚清楚，至今還沒(méi)有分離鑒定臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的統(tǒng)一的特異性標(biāo)志,對(duì)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化造成了很大的障礙。(2)當(dāng)前培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的條件還不甚一致。只有采用一致的和標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)血清培養(yǎng)才能夠?yàn)檫M(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。(3)在體外誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化方面，技術(shù)還不是很成熟。譬如向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，雖然各種各樣的方法都可以成功獲得神經(jīng)樣細(xì)胞，但各種方法誘導(dǎo)的效率并不高，尚不能有效地獲得單一種類的神經(jīng)元細(xì)胞，這給進(jìn)一步臨床應(yīng)用造成很大的不便。(4)成功誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞的機(jī)制還不很清楚，這方面的研究還處于初級(jí)階段。(5)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，距離臨床應(yīng)用還有一定的距離。

總之，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為最有潛力的多潛能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在體外能夠定向誘導(dǎo)分化為各種神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

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