黃健，張鐵濤，鮑坤，楊福合，李光玉，王凱英

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130112）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼養(yǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，畜牧業(yè)對環(huán)境的污染已經(jīng)成為繼工業(yè)污染和生活污染之后又一環(huán)境污染的重要源頭。氮排放是畜牧業(yè)環(huán)境污染的主要問題，特別是尿素和尿囊素的排放，產(chǎn)生了包括NH3和N2O在內(nèi)的大量有害氣體，這些氣體和CO2成為溫室氣體的主要成分［1－2］，同時大量的氮排放導(dǎo)致土壤氮轉(zhuǎn)運(yùn)周期加長，土壤及水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化［3－4］，要求我們在提高動物生產(chǎn)性能的同時降低氮排放［5］。日糧組成是影響氮排放的重要因素［6－7］，降低日糧粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）水平是目前減少氮排放，尤其是尿氮排放的最主要方式。有研究表明，降低日糧 CP水平后會降低生產(chǎn)性能［8－10］，但添加蛋氨酸（methionine，Met）和賴氨酸（lysine，Lys）等限制性氨基酸能改善氨基酸平衡，可以維持甚至提高生產(chǎn)性能，提高氮利用率并減少尿氮的排放［5，11］。國內(nèi)外對梅花鹿低CP氨基酸平衡理論研究甚少，需要在梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)中研究和探索。本試驗(yàn)通過低CP日糧中添加Lys和Met對仔鹿?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)消化代謝、氮平衡及尿嘌呤衍生物（urine purine derivatives，PD）排出量影響的研究，篩選適宜添加水平，為低CP氨基酸平衡日糧技術(shù)在梅花鹿上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和試驗(yàn)設(shè)計

選取4只、3月齡健康離乳雄性梅花鹿仔鹿，體重（30±0.12）kg（珚X±SD）。采用4×4完全拉丁方設(shè)計，Ⅰ組為高蛋白質(zhì)對照組，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為補(bǔ)充Lys和Met的低蛋白質(zhì)試驗(yàn)組。分4個階段進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)，每個階段14d，預(yù)試期為9d，正試期為5d。

1.2 試驗(yàn)日糧及飼養(yǎng)管理

以玉米、豆粕、玉米纖維、酒糟蛋白、玉米胚芽、苜蓿草粉、糖蜜、食鹽、預(yù)混料等按不同比例配制成對照組日糧（CP 16.28%）和試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧（CP 13.40%），試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧添加Lys和Met配制Lys水平相同、Met水平不同的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組試驗(yàn)日糧。將原料混合均勻后，制成直徑0.4cm，長度1.2～1.5cm的全混合日糧（TMR）顆粒料，配方及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)日糧和試驗(yàn)日糧中Lys和Met含量見表2。試驗(yàn)于2013年9月13日－11月7日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所茸鹿實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)動物在特制代謝籠（長×寬×高分別為2.0m×1.2m×2.0m）中單籠飼養(yǎng)，每日8：00和16：00兩次定量飼喂，自由飲水。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experiment diets（air－dry basis）

1.3 樣品采集與分析測定

1.3.1 糞樣采集與測定 采用全收糞法。連續(xù)收集5d，每天稱重并做記錄，準(zhǔn)確稱取10%糞樣在65℃烘箱中烘干至恒重，混合均勻，粉碎過0.425mm篩制成樣品。糞樣中的干物質(zhì)（dry matter，DM）、有機(jī)物（organic matter，OM）、粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、鈣（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）含量，參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)（第2版）》［12］測定，氨基酸（amino acid，AA）采用日立L8900全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.2 尿樣采集與測定 采用全收尿法。在桶內(nèi)加入10%的濃硫酸20mL，保證pH＜3，準(zhǔn)確記錄總尿量，每天取總尿量的10%裝于塑料瓶中低溫保存，連續(xù)收集5d，以備尿樣CP測定。移取20mL尿樣稀釋至100mL制成次級尿樣，裝入塑料瓶內(nèi)－20℃貯存，參照IAEA［13］分光光度計法進(jìn)行PD含量測定。

1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SAS 9.1.3的ANOVA進(jìn)程進(jìn)行單因素方差分析，用DUNCAN法進(jìn)行多重比較分析差異顯著性，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

表2 基礎(chǔ)與試驗(yàn)日糧中Lys和 Met含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 2 Content of Lys and Met in basal diet and test diet（air dry basis） %

2 結(jié)果與分析

2.1 低CP日糧添加Lys、Met對仔鹿?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

如表3所示，對照組CP消化率極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01），顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），而低蛋白日糧添加Lys、Met提高仔鹿CP消化率趨勢明顯，隨Met添加量增加，Ⅱ組～Ⅳ組CP消化率不斷升高，但差異不顯著（P＞0.05）；處理組EE消化率均高于對照組，其中Ⅱ組極顯著地高于對照組（P＜0.01），其余組間差異不顯著（P＞0.05）；DM、OM、Ca、P、NDF、ADF表觀消化率差異不顯著（P＞0.05），Ⅱ組營養(yǎng)物質(zhì)消化率均低于對照組（NDF除外），Ⅱ～Ⅳ營養(yǎng)物質(zhì)消化率隨著Met水平提高而升高，Ⅳ組OM、NDF、ADF、P表觀消化率均優(yōu)于對照組。

表3 日糧添加Lys、Met對仔鹿?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響Table 3 Effects of supplement Lys and Met in diet on nutrients apparent digestibility of deer %

2.2 低CP日糧添加Lys、Met對仔鹿氨基酸表觀消化率的影響

如表4所示，對照組和Ⅳ組Met消化率顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05），對照組、Ⅳ組間無顯著差異（P＞0.05）；組間Lys、Cys消化率差異不顯著（P＞0.05）；其余氨基酸消化率對照組均顯著高于各試驗(yàn)組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組間，與Met代謝相關(guān)的蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、胱氨酸4種氨基酸消化率均為Ⅱ組最低，Ⅳ組最高，隨日糧Met水平升高而升高，而酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸消化率隨日糧Met水平升高而降低，其余氨基酸消化率基本一致。

表4 日糧添加Lys、Met對仔鹿氨基酸消化率的影響Table 4 Effects of supplement Lys and Met in diet on amino acid apparent digestibility of deer %

2.3 低CP日糧中添加Lys、Met對仔鹿氮平衡的影響

如表5所示，對照組氮攝入量高于試驗(yàn)組，并且顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），各組糞氮排放量差異不顯著（P＞0.05）；對照組吸收氮顯著高于Ⅱ組、Ⅲ組（P＜0.01）和Ⅳ組（P＜0.05），但對照組尿氮排放量卻顯著大于各試驗(yàn)組（P＜0.05）；對照組氮沉積略高于試驗(yàn)組，氮利用率和氮表觀生物學(xué)效價低于試驗(yàn)組（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組氮表觀生物學(xué)效價分別比對照組高15.50%，15.17%和20.46%；組間氮沉積無顯著差異（P＞0.05）；氮利用率和表觀生物學(xué)效價普遍低于各試驗(yàn)組（P＞0.05），試驗(yàn)組間參數(shù)隨Met增長而升高趨勢明顯。

表5 日糧中添加Lys、Met對仔鹿氮平衡的影響Table 5 Effects of supplement Lys and Met in diet on the nitrogen balance of deer

2.4 低CP日糧中添加Lys、Me對仔鹿尿嘌呤衍生物的影響

如表6所示，對照組PD總排放量顯著大于Ⅱ組（P＜0.01）和Ⅲ組（P＜0.05），與Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）；尿囊素排放量顯著大于Ⅱ組（P＜0.01）、Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），黃嘌呤和次黃嘌呤極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅲ組、Ⅳ組黃嘌呤和次黃嘌呤極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01），其余各項(xiàng)差異均不顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組尿囊素和總PD排放量隨著Met水平的提高而提高。

表6 日糧中添加Lys、Met對仔鹿尿嘌呤衍生物的影響Table 6 Effects of supplement Lys and Met in diet on the purine derivatives of deer g/d

3 討論

適宜蛋白質(zhì)水平和氨基酸比例能夠發(fā)揮營養(yǎng)物質(zhì)最大消化潛力［14］，營養(yǎng)水平最適時消化率最高，偏離最適營養(yǎng)水平就會降低其消化率，并影響其他營養(yǎng)物質(zhì)消化利用。于麗偉［15］研究表明日糧CP水平16.50%時仔鹿CP消化率最高，本試驗(yàn)對照組CP 16.28%與于麗偉試驗(yàn)水平接近。日糧CP水平降到13.40%日糧可降解蛋白水平相應(yīng)降低，直接導(dǎo)致瘤胃微生物活性減弱，瘤胃微生物對營養(yǎng)物質(zhì)消化能力降低，微生物蛋白（MCP，microbial crude protein）合成隨之降低，仔鹿CP消化率顯著降低，Lee等［16］和Russell等［17］同樣表明奶牛、肉牛CP消化率因日糧CP水平降低而顯著降低；DM和OM消化率同樣因日糧CP水平下降而下降，又隨著Met水平升高而升高，與多種營養(yǎng)物質(zhì)消化率結(jié)果一致；NDF、ADF主要在瘤胃中消化，微生物含量是影響其消化率的關(guān)鍵因子，試驗(yàn)組消化率高于對照組可能是因?yàn)樘砑拥腖ys、Met為游離氨基酸，能被瘤胃微生物直接利用和瘤胃壁吸收，避免降解為氨的過程，從而促進(jìn)微生物生長，本試驗(yàn)NDF，ADF消化率有一定降低，但差異不顯著，與Lee等［16］和Russell等［17］研究結(jié)果不盡相同，可能是因?yàn)長ee等［16］和 Russell等［17］是在自由采食條件下進(jìn)行的，蛋白質(zhì)下降導(dǎo)致適口性降低，引起采食量下降，影響了營養(yǎng)物質(zhì)的消化，而本試驗(yàn)采用定時、定量法飼喂，采食量基本未受影響。此外氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，降低日糧CP水平直接導(dǎo)致氨基酸水平降低，氨基酸缺乏，氨基酸平衡性失當(dāng)，氨基酸消化率降低［18］，Met作為反芻動物限制性氨基酸，是瘤胃微生物代謝的重要參與物，瘤胃微生物含有很高的Met水平［19］，日糧Met水平很難滿足瘤胃微生物的需要，影響營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃代謝，日糧添加Met能滿足瘤胃微生物對Met的需求，平衡瘤胃氨基酸比例，提高瘤胃微生物活性［20］，促進(jìn)瘤胃微生物合成［21］，進(jìn)而提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，本研究多種營養(yǎng)物質(zhì)消化率均隨日糧Met水平增加而增加，Schwab等［22］研究表明，犢牛日糧中添加Met會提高CP消化率，王建紅等［23］通過扣除日糧部分Met研究發(fā)現(xiàn)，扣除部分Met會降低犢牛常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)消化率，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，云強(qiáng)等［11］研究認(rèn)為除粗脂肪外其他常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)消化率隨氨基酸添加量有先增加后降低的趨勢，出現(xiàn)不同結(jié)果的原因很有可能本試驗(yàn)添加Met量沒有達(dá)到仔鹿最適Met水平，或者還沒有超過仔鹿對Met的耐受能力；同時，本試驗(yàn)研究表明試驗(yàn)組日糧中添加Lys與對照組相同后，獲得與對照組相似的Lys消化率，添加Met能顯著提高M(jìn)et消化率，與張鐵濤等［24］研究結(jié)果一致，且氨基酸的相互作用會在體內(nèi)重分配而保證機(jī)體的穩(wěn)定［25］，Met消化率提高會促進(jìn)體內(nèi)以Met為前體的反應(yīng)產(chǎn)物或中間體（如胱硫醚、谷胱甘肽等）含量增加，胱硫醚在瘤胃中往往需要Met才能合成［26］，是半胱氨酸和絲氨酸的結(jié)合物，日糧中Met增加會提高胱硫醚合成酶的活性［27］，需要大量的半胱氨酸、絲氨酸參與反應(yīng)，提高半胱氨酸、絲氨酸消化率，甘氨酸合成的中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物可以接受蛋氨酸分離的甲基碳［28］，也是組成谷胱甘肽的氨基酸之一，日糧Met水平增加能促進(jìn)谷胱甘肽合成［29］，促進(jìn)甘氨酸代謝，提高甘氨酸消化率。

在采食量相同時，降低日糧CP水平顯著降低了氮攝入量，且對照組的CP消化率顯著高于試驗(yàn)組，導(dǎo)致吸收氮顯著高于試驗(yàn)組，糞氮差異不顯著，但動物組織合成能力有限，氮沉積無明顯差異，多余的氮會從尿液排出，尿氮排放量顯著增加，進(jìn)而提高了試驗(yàn)組氮利用率和氮生物學(xué)效價，減少了大量的氮排放，有效緩解了環(huán)境污染。Varel等［30］研究發(fā)現(xiàn)奶牛日糧CP從18.4%降低到15.1%，尿氮排放量從35%降低到23%，本研究將仔鹿日糧CP從16.28%降低到13.4%，尿氮排放量45%降低到38%。董全民等［6］認(rèn)為，CP為16.1%的日糧中加入一定氨基酸與擁有18.8%CP日糧的奶牛有相同的生產(chǎn)性能，同時減少了氮損失，但并不影響尿氮或糞氮的排泄，與本研究結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)沒有添加非蛋白氮，蛋白氮是食入氮的唯一來源，被瘤胃微生物利用而合成微生物蛋白（MCP），在小腸中降解后被動物吸收，并在體內(nèi)代謝最終轉(zhuǎn)化為尿嘌呤衍生物（PD），研究認(rèn)為反芻動物尿中PD主要是由MCP轉(zhuǎn)化而來，只有極少部分轉(zhuǎn)換為體內(nèi)組織，剩余部分隨尿液排出體外［31］，其含量與MCP產(chǎn)量呈高度正相關(guān)，能直接反映MCP的產(chǎn)量［32］，PD也是尿中的主要含氮物質(zhì)之一，對照組尿囊素和總PD顯著高于試驗(yàn)組也是尿氮變化的間接表現(xiàn)。本試驗(yàn)表明仔鹿日糧添加Met能促進(jìn)尿囊素和總PD排放量增加，間接表明日糧補(bǔ)充Met可促進(jìn)瘤胃MCP產(chǎn)量的增加，White等［33］研究發(fā)現(xiàn)日糧添加Met能促進(jìn)總PD和尿囊素排放，提高M(jìn)CP的合成，燕磊［21］研究同樣表明日糧添加Met能增加瘤胃微生物對氨氮的利用率，MCP的合成增加、細(xì)菌氮濃度相應(yīng)增加、氨氮的濃度降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。同時，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加Met能促進(jìn)仔鹿氮沉積、氮利用率及氮生物學(xué)效價，與王建紅等［23］、Abe等［34］認(rèn)為在日糧中添加 Met會促進(jìn)犢牛增重和提高氮沉積，Oke等［35］報道綿羊的氮沉積與日糧Met水平呈正相關(guān)結(jié)果是相同的。但Schwab等［22］報道，斷奶犢牛皺胃灌注L－Met的理想劑量約為0.06%，當(dāng)添加到0.12%時，氮沉積開始下降，而本實(shí)驗(yàn)添加到0.12%時仍繼續(xù)增加，出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是Schwab等［22］使用的是L－Met，利用率高于本試驗(yàn)中的DL－Met，并且飼喂氨基酸會被瘤胃微生物部分降解，其利用率亦有可能低于直接灌注晶體氨基酸的利用效率?？梢娺m當(dāng)降低仔鹿日糧蛋白水平，添加Lys、Met對營養(yǎng)物質(zhì)消化利用、降低氮排放量是有益的，仔鹿Met需要量有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%會降低氮沉積，補(bǔ)充Lys、Met后氮沉積和氮利用率升高，氮排放減少、降低環(huán)境污染；（2）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%會造成CP、氨基酸消化率下降，補(bǔ)充Lys、Met能有效改善氮平衡，提高多種營養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進(jìn)MCP合成；（3）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%補(bǔ)充0.23%Lys和0.12%Met是可行的。

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