王紹飛，黃琳凱，張新全，馬嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014）

多花黑麥草（Loliummultiflorum）因具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)南方地區(qū)糧草輪作中發(fā)揮了極其重要的作用，是南方地區(qū)推廣面積最大的栽培牧草之一［1－4］。我國(guó)多花黑麥草育種工作起步晚，育成品種較少，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中多使用引進(jìn)品種［5］，主推品種遺傳背景狹窄，因此怎樣加快育種步伐，育成一批適應(yīng)我國(guó)不同生態(tài)區(qū)實(shí)際生產(chǎn)需要的新品種成為亟待解決的問(wèn)題之一［6］。近年來(lái)，越來(lái)越多的育種者采用標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）的方法，從分子標(biāo)記的角度評(píng)價(jià)育種材料，避免環(huán)境等外界因素的影響，期望加快育種周期［7－13］。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在了多花黑麥草等牧草育種工作中。如Inoue和Gao［14］利用RFLP、AFLP、TASs（端粒重復(fù)相關(guān)序列）標(biāo)記對(duì)多花黑麥草構(gòu)建高密度連鎖圖。Eduardo和Caroline［15］（2004）利用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自巴西及烏拉圭的4個(gè)多花黑麥草群體做了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同地區(qū)的多花黑麥草群體間差異不明顯。季楊等［16］（2008）采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)多花黑麥草12個(gè)雜交組合的親本與后代共70個(gè)材料進(jìn)行研究，通過(guò)分析雜種與雙親之間的擴(kuò)增譜帶多態(tài)性，鑒別真假雜種。楊文軒等［17］（2010）利用SSR、SRAP標(biāo)記對(duì)6個(gè)多花黑麥草親本品種及其9個(gè)雜交F2代組合80份材料進(jìn)行遺傳分析，揭示了親本與其雜交后代間的遺傳關(guān)系。

材料間雜交是植物育種的基本手段之一，但多花黑麥草屬于異花授粉植物，不能采用系譜法進(jìn)行育種，在形成雜交基礎(chǔ)群體之后一般進(jìn)行混合選擇。在國(guó)內(nèi)外研究中，鮮見(jiàn)多花黑麥草群體改良效果及其群體內(nèi)、群體間的遺傳變異的分子標(biāo)記評(píng)價(jià)的報(bào)道。本研究以2個(gè)多花黑麥草雜交世代材料及其親本為試驗(yàn)材料，利用多花黑麥草基因組SSR標(biāo)記從分子水平分析混合選擇對(duì)多花黑麥草雜交群體遺傳多樣性的影響，并評(píng)價(jià)各輪群體的遺傳變異情況，以期為已有的雜交后代群體的進(jìn)一步遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的供試材料包括2個(gè)多花黑麥草雜交組合［劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）、長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）］的各混合選擇改良后代群體及其親本共12份材料的360個(gè)單株（表1）。2008年5月，用人工去雄授粉的方法，將國(guó)審主推品種“長(zhǎng)江2號(hào)”（四倍體）與國(guó)外引進(jìn)品種“劍寶”（四倍體）選擇多個(gè)優(yōu)異單株進(jìn)行正反雜交，2個(gè)雜交組合分別混收后代群體種子，然后每年對(duì)各雜交子代群體進(jìn)行混合選擇，選擇目標(biāo)是植株高大、分蘗多、葉片寬大、冬季生長(zhǎng)速度快等，到目前為止，共進(jìn)行了5輪（代）混合選擇。

表1 供試材料信息Table 1 The information of the tested materials

1.2 DNA提取及檢測(cè)

2013年2月參試的12份多花黑麥草材料，每份材料隨機(jī)選取30個(gè)健康單株，用其嫩葉按照CTAB法提取其單株基因組DNA。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度及濃度，符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA存放于－20℃冰箱備用。純度及濃度不符合要求的，重新提取DNA。

1.3 SSR－PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)

SSR－PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為15μL，包括：DNA 1μL（10ng/μL）、PCR－Mix 7.5μL（北京天根生化供試），正、反向引物各0.4μL（10pmol/μL），Taq DNA聚合酶0.3μL（2.5U/μL），ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序采用touchdown PCR：94℃預(yù)變性5min；10個(gè)降落循環(huán)：94℃變性30s，65℃開(kāi)始每個(gè)循環(huán)降低0.5℃復(fù)性45s，直至60℃、72℃延伸1min；94℃變性30s，60℃復(fù)性45s、72℃延伸1min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；10℃保存。引物采用最新開(kāi)發(fā)的多花黑麥草基因組SSR引物［18］。

擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)，先用200V恒定電壓預(yù)電泳30min，再在樣孔中每個(gè)樣品點(diǎn)樣6～8 μL，以50bp ladder為分子量標(biāo)準(zhǔn)，并用400V電壓電泳2h，參照許紹斌等［19］的方法銀染。電泳檢測(cè)重復(fù)2次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

由于供試材料均為同源四倍體，利用SSR標(biāo)記難以辨別雜合基因型，故本研究將SSR標(biāo)記不進(jìn)行基因型判定，按照如下方法處理：按點(diǎn)樣順序?qū)Σ煌琒SR引物擴(kuò)增分子量范圍內(nèi)的多態(tài)性條帶逐條記錄，對(duì)相同分子量的條帶按有無(wú)分別賦值，有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)成二元數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)（total No.of bands，TNB）和多態(tài)性條帶數(shù)量（No.of polymorphic bands，NPB），計(jì)算多態(tài)性百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）。利用POPGENE軟件計(jì)算各群體的Shannon多樣性指數(shù)及Nei’s基因多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選及其多態(tài)性分析

從100對(duì)SSR引物中篩選出來(lái)20對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好的引物（表2），對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到217條清晰可辨條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為10.9條；其中多態(tài)性條帶共有202條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出10.1條多態(tài)性條帶，引物的平均多態(tài)性條帶百分率達(dá)到92.2%。表明這20對(duì)SSR引物具有較高的檢測(cè)效率。

表2 用于多花黑麥草SSR分析的引物序列和多態(tài)性Table 2 Primer sequences and amplification results from SSR analyses of L.multiflorum

2.2 各雜交后代群體的SSR擴(kuò)增條帶分析

通過(guò)條帶類(lèi)型統(tǒng)計(jì)，對(duì)各參試多花黑麥草材料條帶類(lèi)型做劃分，計(jì)算各類(lèi)型條帶數(shù)在總條帶數(shù)中所占的比重，可以分析各雜交世代材料在條帶類(lèi)型上的變化。如表3所示，具有該類(lèi)型條帶的記為“＋”，不具有該類(lèi)型條帶的記為“－”，當(dāng)某條帶在群體中出現(xiàn)頻率高于70%時(shí)可看作該群體的共有條帶。條帶類(lèi)型被劃為7類(lèi)。Ⅰ類(lèi)：條帶在父本、母本、子代中都出現(xiàn)；Ⅱ類(lèi)：條帶在雙親中均出現(xiàn)，而子代中沒(méi)有出現(xiàn)；Ⅲ類(lèi)：條帶在父本及子代中出現(xiàn)，而母本沒(méi)有出現(xiàn)；Ⅳ類(lèi)：條帶僅在父本中出現(xiàn)，而母本和子代中均沒(méi)有出現(xiàn)；Ⅴ類(lèi)：條帶在母本及子代中出現(xiàn)，而父本中沒(méi)有出現(xiàn)；Ⅵ類(lèi)：條帶僅在母本中出現(xiàn)，而父本和子代中均沒(méi)有出現(xiàn)；Ⅶ類(lèi)：條帶僅在子代中出現(xiàn)，而父母本中均沒(méi)有出現(xiàn)。

從條帶類(lèi)型占條帶總數(shù)百分比看，各群體均具有上述7種條帶類(lèi)型（圖1，圖2）。Ⅰ類(lèi)條帶反映雙親對(duì)后代的遺傳貢獻(xiàn)，它在各類(lèi)型條帶中的比例最大，約占30.5%～38.6%，雜交世代組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”中，C3（F1）＞C4（F2），C4（F2）＜C5（F3）＜C6（F4）＜C7（F5）；雜交世代組合“長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）”中，C8（F1）＞C9（F2），C9（F2）＜C10（F3）＜C11（F4）＜C12（F5）。2個(gè)組合中均表現(xiàn)出F2＜F1＜F3＜F4＜F5的規(guī)律。Ⅱ類(lèi)條帶占條帶總數(shù)的百分比可以反映子代對(duì)雙親條帶的缺失情況：雜交世代組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”中，C4（F2）＞C3（F1）＞C5（F3）＞C6（F4）＞C7（F5），而雜交世代組合“長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）”各群體間擁有相同的規(guī)律。Ⅰ、Ⅱ類(lèi)條帶類(lèi)型的統(tǒng)計(jì)規(guī)律表明各雜交世代群體中F2代出現(xiàn)最大的遺傳分離，從F3代起各世代材料繼承雙親遺傳背景的比例越來(lái)越高，而產(chǎn)生的新的遺傳變異越來(lái)越少。Ⅲ類(lèi)條帶與Ⅴ類(lèi)條帶的總數(shù)表示子代具有父本或者母本一方的特征帶總數(shù)。Ⅳ類(lèi)條帶與Ⅵ類(lèi)條帶的總數(shù)表示子代同時(shí)缺失父本和母本的特異性條帶總數(shù)。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，相對(duì)于F1及F2代，F(xiàn)3、F4及F5代繼承父本或母本一方的特異性條帶的比例呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì)，而同時(shí)缺失父本和母本特異性條帶的比例也在逐漸減少，說(shuō)明F3、F4及F5代更多的繼承了父母本的分子特性，出現(xiàn)較少的遺傳變異。而Ⅶ類(lèi)條帶表示子代特有的條帶，各世代材料表現(xiàn)出F1＞F2，F(xiàn)2＜F3＜F4＜F5的規(guī)律，表明雜交子代具有的特異性條帶數(shù)有增多的趨勢(shì)。

圖1 SSR引物L(fēng)MgSSR01－05F的擴(kuò)增電泳圖Fig.1 SSR amplified results with primer pair LMgSSR01－05F

圖2 SSR引物L(fēng)MgSSR02－05E的擴(kuò)增電泳圖Fig.2 SSR amplified results with primer pair LMgSSR02－05E

表3 雜交組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”和“長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）”各世代條帶類(lèi)型統(tǒng)計(jì)Table 3 The band types of cross combination“Jumbo（♀）×Changjiang No.2（♂）”and“Changjiang No.2（♀）×Jumbo（♂）”

2.3 不同雜交世代群體間的遺傳變異比較

多態(tài)性條帶百分率（PP）、Shannon多樣性指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性（Ho）等都是能夠反映群體內(nèi)的遺傳多樣性豐富程度或群體變異程度的指標(biāo)。對(duì)供試的多花黑麥草各群體進(jìn)行多態(tài)性條帶統(tǒng)計(jì)（表4），發(fā)現(xiàn)20對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物共擴(kuò)增出217個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶比例為92.2%。雜交世代組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”的改良群體中，各世代群體的多態(tài)性條帶數(shù)出現(xiàn)先增后減的規(guī)律，表明遺傳變異在C4（F2）群體中達(dá)到最多之后依次減少。C3、C4群體的多態(tài)性條帶數(shù)高于兩親本C1、C2的多態(tài)性條帶數(shù)，雜交使多花黑麥草群體早代（F1、F2）的遺傳變異增多。雜交世代組合“長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）”的改良群體也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

表4 供試材料的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity indexes of tested materials

利用Popgene計(jì)算C1～C12各群體的I和Ho指數(shù)，進(jìn)而計(jì)算群體平均遺傳多樣性指數(shù)（Hpop）及總?cè)后w遺傳多樣性指數(shù)（Hsp），分析遺傳多樣性在群體內(nèi)和群體間的分布。結(jié)果表明，雜交世代組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”的各改良群體（C3～C7）中各群體世代的Shannon多樣性指數(shù)和Nei’s基因多態(tài)性總體是減小的，即改良群體內(nèi)的遺傳變異逐步降低。C3（F3）～C7（F5）群體的平均多樣性指數(shù)（Hpop）為1.382，總的群體遺傳多樣性指數(shù)（Hsp）為1.912，即遺傳多樣性72.3%分布在群體內(nèi)，27.7%分布在群體世代間，說(shuō)明雜交組合“劍寶（♀）×長(zhǎng)江2號(hào)（♂）”的各世代改良群體內(nèi)的遺傳多樣性遠(yuǎn)大于各輪改良群體間的遺傳多樣性，這符合多花黑麥草異花授粉的繁育方式［20］。在雜交世代組合“長(zhǎng)江2號(hào)（♀）×劍寶（♂）”中，各輪改良群體（C8～C12）也表現(xiàn)出隨著選擇世代的增加遺傳變異減少的情況，且有75.2%的遺傳多樣性存在于群體內(nèi)，24.8%的遺傳多樣性存在于群體間。

3 討論與結(jié)論

本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)混合選擇下的2個(gè)多花黑麥草雜交后代5輪改良群體的遺傳變異進(jìn)行分析。從條帶類(lèi)型的變化上看，多花黑麥草雜交群體隨著混合選擇的進(jìn)行，SSR引物擴(kuò)增出來(lái)的與父母本共有的非特異性條帶數(shù)增多，缺失親本特異性條帶數(shù)減少，即群體的遺傳變異減少。遺傳多樣性參數(shù)也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，各改良群體的遺傳多樣性指數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性條帶百分率等都隨著選擇的不斷進(jìn)行呈現(xiàn)出減小。關(guān)于供試多花黑麥草群體內(nèi)遺傳變異隨選擇世代的增加而下降的原因，這可能是連續(xù)對(duì)多花黑麥草株高、葉寬等性狀定向選擇導(dǎo)致遺傳漂變產(chǎn)生新的育種群體的結(jié)果［21］。此外在條帶類(lèi)型分析中發(fā)現(xiàn)，雜交子代有缺失雙親共有條帶（Ⅱ類(lèi)條帶）及出現(xiàn)非雙親條帶（Ⅶ類(lèi)條帶）的情況。若親本的基因型雜合，子代可能會(huì)出現(xiàn)雙隱性基因型，再經(jīng)過(guò)人工選擇就會(huì)出現(xiàn)Ⅱ類(lèi)缺少條帶。雜交中子代的DNA序列也可能會(huì)出現(xiàn)非孟德?tīng)柺降淖儺?，子代DNA序列中可能出現(xiàn)非親本序列，從而有了Ⅶ類(lèi)條帶。國(guó)內(nèi)外研究中已有同類(lèi)報(bào)道，存在雜交子代缺失親本序列和出現(xiàn)非親本序列的現(xiàn)象［22－23］。

多花黑麥草通過(guò)雜交可以使其早代（F1、F2）的遺傳多樣性增加，但是隨著選擇的進(jìn)行，群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性會(huì)因連續(xù)對(duì)性狀的定向選擇以及因群體數(shù)量和選擇強(qiáng)度加大所引起的遺傳漂變而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，在多花黑麥草雜交育種過(guò)程中，應(yīng)盡可能擴(kuò)大群體規(guī)模，增加有效群體的含量或增加新的優(yōu)良外源種質(zhì)，并適當(dāng)降低選擇強(qiáng)度，來(lái)減小遺傳漂移，以保持育種群體的遺傳多樣性。同時(shí)，繼續(xù)保持適度選擇壓力，對(duì)F6等世代繼續(xù)檢驗(yàn)其與親本和各雜交世代群體內(nèi)多樣性的差異性，還應(yīng)從表型和具有群體診斷性的高頻率穩(wěn)定條帶上來(lái)檢驗(yàn)新群體與原始親本群體的差異，為新品種選育提供直接證據(jù)。

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