李君風(fēng)，孫肖慧，原現(xiàn)軍，郭剛，4，肖慎華，巴桑，余成群，邵濤＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇 南京210095；2.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京100101；3.西藏日喀則地區(qū)草原工作站，西藏 日喀則857000；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，山西 太谷030801）

西藏地處青藏高原西南部，素以“世界屋脊”著稱，由于海拔高度不同，農(nóng)區(qū)和牧區(qū)明顯分離［1］。藏北牧區(qū)冬寒期長達(dá)7個(gè)月，天然草地生長期短暫，生產(chǎn)力水平低，難以為草食動物提供充足的飼草；畜牧業(yè)生產(chǎn)上存在“冬瘦、春死、夏肥、秋壯”的惡性循環(huán)［2－3］，而農(nóng)區(qū)海拔較低，有較多的降雨量和較高的溫度，牧草產(chǎn)量相對較高，所以在農(nóng)區(qū)開展優(yōu)質(zhì)牧草種植，調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯飼料供牧區(qū)冬春季節(jié)草食動物利用，是解決藏北牧區(qū)冬春季節(jié)飼草料短缺的有效途徑。由于西藏地區(qū)交通運(yùn)輸不便，青貯飼料開窖并分發(fā)到養(yǎng)殖戶，需要較長時(shí)間，加之養(yǎng)殖戶不懂得科學(xué)管理，剩余的青貯飼料散堆散放，易造成發(fā)霉變質(zhì)，飼喂霉變的青貯飼料會影響家畜健康和畜產(chǎn)品品質(zhì)，因此在西藏地區(qū)研究青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性顯得尤為重要。

乙酸是發(fā)酵抑制劑，同時(shí)可以參與動物的能量代謝，也是反芻動物合成脂肪的主要前體物質(zhì)，能有效地提高乳脂率，對動物無毒害作用。Schmidt和Kung［4］研究表明，添加乙酸后能有效地降低pH，抑制青貯飼料中好氧性微生物的活性，防止青貯飼料的腐敗變質(zhì)。因此，將外源性的乙酸作為添加劑，能有效地提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。

燕麥（Avenasativa）和紫花苜蓿（Medicagosativa）是西藏主要栽培牧草，燕麥水溶性碳水化合物含量高，粗蛋白含量低，單獨(dú)青貯易于成功［5］。紫花苜蓿富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素，是目前國內(nèi)外廣泛栽培的豆科牧草之一，應(yīng)用前景廣闊，但由于其含糖量低、緩沖能高，不能保證青貯過程中乳酸發(fā)酵占優(yōu)勢地位，因此單獨(dú)青貯較難成功。將兩種牧草混合青貯，既能解決紫花苜蓿單獨(dú)青貯難以成功的問題，又可以有效調(diào)控青貯原料的乳酸菌發(fā)酵底物和青貯飼料的蛋白質(zhì)水平，改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的同時(shí)也提高了青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值和適口性。王奇等［6］關(guān)于西藏葦狀羊茅（Festucaarundinacea）和箭筈豌豆（Viciasativa）混貯的研究結(jié)果也表明了豆科牧草和禾本科牧草混合青貯能改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)根據(jù)燕麥和紫花苜?；旌锨噘A比例篩選研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，探討添加不同水平的乙酸對混合青貯發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響，以指導(dǎo)西藏地區(qū)優(yōu)質(zhì)青貯飼料的生產(chǎn)和利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在西藏山南地區(qū)貢嘎縣崗堆鎮(zhèn)吉納村試驗(yàn)地開展，該地區(qū)位于西藏自治區(qū)南部，處于雅魯藏布江中游河谷區(qū)和江南高山寬谷區(qū)。地勢西高東低，平均海拔3750m。屬高原帶干旱季風(fēng)氣候區(qū)，日照射時(shí)間長，氣溫日差較大，年差較小，冬春寒冷多風(fēng)，雨季降水集中，形成長冬無夏，春秋相邊的氣候特點(diǎn)。年降水量為356.6mm，集中在6－9月份。牧草和糧食作物均在該季節(jié)收獲。

試驗(yàn)將種植于西藏山南地區(qū)貢嘎縣崗堆鎮(zhèn)吉納村試驗(yàn)地的燕麥和紫花苜蓿于2012年9月15日刈割，刈割后在田間用鍘刀切成2cm左右，將70%燕麥和30%紫花苜蓿充分混勻，作為青貯材料。燕麥為乳熟期，紫花苜蓿處于第2茬初花期。各青貯材料化學(xué)成分見表1，微生物組成見表2。

表1 青貯前燕麥和紫花苜蓿主要化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

表2 青貯前燕麥和紫花苜蓿微生物組成Table 2 Microbial composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)對照組和3個(gè)不同添加劑處理組：①對照組（CA，無添加）；②0.3%乙酸添加組（0.3A）；③0.4%乙酸添加組（0.4A）；④0.5%乙酸添加組（0.5A），在青貯后第30，45，60天分別打開青貯窖，取樣分析發(fā)酵品質(zhì)；剩余實(shí)驗(yàn)室青貯窖在青貯60d后打開，用鑷子掏松，使空氣充分滲入，在隨后的第5，10，15天取樣分析有氧暴露過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化。每個(gè)處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5個(gè)重復(fù)，共計(jì)120個(gè)實(shí)驗(yàn)室青貯窖。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯飼料的調(diào)制 將燕麥和紫花苜蓿分別刈割，用鍘刀切成2cm左右，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例（7∶3）稱取混勻，加入添加劑，充分混勻后裝填至2L的實(shí)驗(yàn)室青貯窖中，壓實(shí)蓋上內(nèi)外蓋，并用膠帶密封，置于室溫條件下保存。

1.3.2 樣品處理 在青貯第30，45和60天分別打開實(shí)驗(yàn)室青貯窖取出全部青貯飼料，將其混合均勻稱取35g放入100mL的廣口三角瓶，加入70g去離子水，4℃浸提24h，然后通過2層紗布和定性濾紙過濾，所得液體為青貯飼料浸提液，置于－20℃冷凍冰箱保存待測。濾液用來測定pH值、乳酸（lactic acid，LA）、氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，AN）和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），將剩余部分青貯飼料收集烘干，測定干物質(zhì)（dry matter，DM）、總氮（total nitrogen，TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）。

1.3.3 測定項(xiàng)目及分析方法 原料草和青貯飼料在65℃烘箱中干燥60h至恒定重量，測定干物質(zhì)含量（dry matter，DM）；緩沖能（buffer capacity，BC）測定用鹽酸－氫氧化鈉滴定法；pH值用pH211型精密pH計(jì)（HANNA公司）測定；乳酸含量（lactic acid，LA）用對－羥基聯(lián)苯比色法測定；水溶性碳水化合物用蒽酮硫酸比色法測定；氨態(tài)氮采用苯酚－次氯酸鈉比色法測定；總氮用KjeltecTM2300型全自動凱氏定氮儀測定；乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸用GC－14B型氣相色譜儀（日本島津公司），色譜條件：柱溫125℃，汽化室溫度180℃，檢測器溫度220℃，檢測器FID，載氣為氮?dú)?，壓力?.05MPa，氫氣壓力為0.05MPa，空氣壓力為0.05MPa［7］。乳酸菌、好氧性細(xì)菌、酵母菌和霉菌數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法，分別選用MRS（deMan－Rogosa－Sharpe）瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar），35℃恒溫培養(yǎng)2～3d，對菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)［8］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS（8.2）軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析（One－Way ANOVA），并用鄧肯氏（Duncan）方法對處理間及青貯天數(shù)間平均數(shù)進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料燕麥和紫花苜?；瘜W(xué)與微生物成分分析

青貯原料燕麥干物質(zhì)、水溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均高于紫花苜蓿（P＜0.05）；而紫花苜蓿的粗蛋白含量、緩沖能較燕麥高（P＜0.05）（表1）。紫花苜蓿的好氧性細(xì)菌數(shù)量高于燕麥（P＜0.05），其他微生物的數(shù)量兩種材料間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

2.2 添加乙酸對燕麥和紫花苜?；旌锨噘A過程中干物質(zhì)、pH和乳酸含量的影響

整個(gè)青貯過程中，各組干物質(zhì)含量變化不顯著（P＞0.05）（表3）。各組pH值變化不大，但隨著乙酸添加量的增加，pH值呈下降趨勢，且各處理組pH值均顯著（P＜0.05）低于對照組，0.4%與0.5%乙酸處理組顯著低于0.3%乙酸處理組（P＜0.05）。隨著青貯時(shí)間的延長，乳酸含量總體呈上升趨勢，各處理組乳酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），在青貯第45天，0.4%乙酸添加組乳酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），發(fā)酵60d后處理組仍顯著高于對照組（P＜0.05），但處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 添加乙酸制劑對混合青貯過程中pH、干物質(zhì)和乳酸含量的影響Table 3 Effect of adding acetic acid on pH，DM and LA contents of mixed silages during ensiling

2.3 添加乙酸對燕麥和紫花苜?；旌锨噘A過程中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

隨著青貯時(shí)間的延長，各組乙酸含量呈升高趨勢（表4），處理組乙酸含量高于對照組（P＜0.05），并隨著乙酸添加量的增加，青貯飼料中乙酸含量明顯提高（P＜0.05），但到青貯第60天，各處理組間乙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。整個(gè)青貯過程，丙酸、丁酸含量各組間差異不顯著（P＞0.05），總揮發(fā)性脂肪酸變化趨勢與乙酸一致。

表4 添加乙酸制劑對混合青貯過程中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 4 Effect of adding acetic acid on volatile fatty acid contents of mixed silages during ensiling

2.4 添加乙酸對燕麥和紫花苜?；旌锨噘A氨態(tài)氮/總氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影響

在整個(gè)青貯過程中乳酸/乙酸雖有波動（表5），但整體變化不顯著（P＞0.05），添加0.4%乙酸處理組乳酸/乙酸最高。各組氨態(tài)氮/總氮呈逐漸上升的趨勢，在青貯第60天，各處理組均低于對照組（P＜0.05），并且隨著乙酸添加量的增加氨態(tài)氮/總氮有降低趨勢。隨著青貯時(shí)間的延長，各組水溶性碳水化合物均呈下降趨勢，并隨著乙酸添加量的增加有提高趨勢，各處理組高于對照組（P＜0.05），其中0.4%乙酸處理組顯示最高的水溶性碳水化合物。

2.5 添加乙酸對開窖后有氧暴露過程中pH值、氨態(tài)氮/總氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量的影響

在有氧暴露的前10d，pH基本保持穩(wěn)定（圖1），之后到有氧暴露15d，pH值呈升高趨勢，其中各處理組pH值均低于對照組（P＜0.05），而各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在整個(gè)有氧暴露階段乳酸含量整體呈下降趨勢，各處理組均高于對照組（P＜0.05），其中0.4A處理組乳酸含量保持最高。整個(gè)有氧暴露階段各組水溶性碳水化合物含量均有不同程度下降，其中對照組10d后顯著下降，0.4%和0.5%乙酸添加組水溶性碳水化合物含量始終高于對照組（P＜0.05）。整個(gè)有氧暴露階段氨態(tài)氮/總氮值總體變化不大，在有氧暴露5和10d，處理組低于對照組（P＜0.05），而處理組間差異不顯著（P＞0.05），至有氧暴露15d，0.5%乙酸處理組的氨態(tài)氮/總氮最低，并顯著（P＜0.05）低于其他組。

表5 添加乙酸制劑對混合青貯過程中氨態(tài)氮/總氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影響Table 5 Effect of adding acetic acid on the value of ammonia nitrogen/total nitrogen and lactic acid/acetic acid，and the content of water soluble carbohydrates of mixed silages during ensiling

圖1 有氧暴露過程中不同乙酸添加組pH值、氨態(tài)氮/總氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量變化Fig.1 Changes of contents of lactic acid and water soluble carbohydrate，pH value and ammonia/total nitrogen of mixed silages adding with acetic acid treatments during aerobic exposure

3 討論

3.1 添加不同水平乙酸對全株燕麥和紫花苜?；旌锨噘A發(fā)酵品質(zhì)的影響

有機(jī)酸及其鹽類可迅速降低青貯初期的pH值，抑制植物酶和微生物活性，已被作為青貯發(fā)酵抑制劑廣泛應(yīng)用于青貯飼料生產(chǎn)中［9－10］，其中乙酸作為常用的消毒防腐劑，能抑制霉菌、酵母等有害微生物的生長和繁殖，減少對發(fā)酵底物的消耗，為乳酸菌的生長繁殖提供良好條件。

本試驗(yàn)將乙酸添加到全株燕麥和紫花苜?；旌锨噘A中，結(jié)果顯示青貯30d各組pH值均已降至4.0以下，且之后均維持在穩(wěn)定狀態(tài)，其中乙酸添加組的pH較低，乳酸和水溶性碳水化合物含量較高，這可能是由于添加乙酸抑制了早期好氧性微生物的活性，減少了好氧性微生物與乳酸菌對水溶性碳水化合物的競爭，為乳酸菌節(jié)省了底物，產(chǎn)生了更多的乳酸，在青貯結(jié)束時(shí)有較多的水溶性碳水化合物殘留，進(jìn)而提高了水溶性碳水化合物的利用效率［11］。Moon［12］研究顯示濃度大于100mmol/L的乙酸鹽即可有效抑制酵母等微生物的生長。張新慧等［13］研究了2種乙酸鹽（雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉）對玉米（Zeamays）青貯的影響，結(jié)果顯示將脫氫乙酸鈉加入玉米青貯中抑制了細(xì)菌及真菌的活動，較大程度地保留了飼料中水溶性碳水化合物和營養(yǎng)物質(zhì)。許慶方等［14］研究發(fā)現(xiàn)添加0.2%乙酸顯著降低了玉米青貯飼料的pH值，對玉米青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善效果優(yōu)于綠汁發(fā)酵液。而本研究中0.3%乙酸添加組pH值低于對照，但高于0.4%和0.5%乙酸添加組，且乳酸含量也低于這二者，而0.5%添加組各時(shí)間點(diǎn)乳酸含量均低于0.4%添加組，這可能是由于乙酸添加量不同造成而引起的，表明全株燕麥和紫花苜蓿混合青貯時(shí)添加0.3%的乙酸對有害微生物的抑制效果不及0.4%，而添加0.5%乙酸不僅抑制了有害微生物活性，也對乳酸菌活性造成了一定的影響。

Henderson［15］曾報(bào)道指出發(fā)酵品質(zhì)良好的青貯飼料氨態(tài)氮/總氮應(yīng)小于80g/kg TN，氨態(tài)氮主要由青貯過程中蛋白質(zhì)和氨基酸降解產(chǎn)生，直接影響青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值，是評定青貯飼料優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)青貯60d后對照組略高于此值，而乙酸添加組均低于此值，這與乙酸對微生物的抑制效果有關(guān)。有機(jī)酸常作為發(fā)酵抑制劑應(yīng)用到青貯飼料生產(chǎn)中，其中Shao等［16］將0.1%山梨酸添加到黑麥草（Loliumperenne）青貯中，發(fā)現(xiàn)山梨酸可有效提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，高效地抑制了梭菌和其他好氧性微生物的生長。張?jiān)鲂篮蜕蹪?7］在多花黑麥草（Loliummultiflorum）青貯時(shí)添加0.25%丙酸，顯著降低了氨態(tài)氮含量，更好地保存青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值。

3.2 添加不同水平乙酸對全株燕麥和紫花苜?；旌锨噘A飼料有氧穩(wěn)定性的影響

Wilkinson和Davies［18］指出未解離短鏈脂肪酸以被動運(yùn)輸?shù)男问竭M(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部，之后釋放H＋降低內(nèi)部pH值，從而殺死細(xì)胞，抑制真菌等微生物的生長繁殖，而乙酸和丙酸的解離程度低于乳酸，可以有效抑制青貯飼料有氧暴露階段酵母、霉菌和真菌的生長繁殖，因此乙酸和丙酸含量已成為預(yù)測青貯有氧穩(wěn)定性優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。青貯窖打開后，厭氧環(huán)境被破壞，好氧性微生物開始活躍，對照組pH隨著有氧暴露時(shí)間的延長顯著上升，而乙酸添加組間基本保持穩(wěn)定無顯著變化，各組乳酸和水溶性碳水化合物含量均隨著暴露時(shí)間的延長而降低，其中對照組的乳酸和水溶性碳水化合物含量最低，氨態(tài)氮/總氮最高，這是由于好氧性微生物對乳酸、水溶性碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸的降解引起，而乙酸可以抑制有氧階段好氧性微生物對營養(yǎng)成分的降解，從而達(dá)到保存青貯飼料養(yǎng)分和提高有氧穩(wěn)定性的目的［19］。Danner［20］研究了乳酸、1，2－丙二醇和乙酸等對全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響，證實(shí)乙酸能夠有效抑制好氧性微生物的生長，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

從pH、氨態(tài)氮、乳酸及水溶性碳水化合物含量等指標(biāo)的動態(tài)變化來看，添加乙酸可以改善燕麥和紫花苜?；旌锨噘A發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。添加0.4%乙酸對好氧性微生物的抑制效果優(yōu)于0.3%乙酸添加組，而添加0.5%乙酸盡管抑制了好氧性微生物活性，但對乳酸菌活性也造成了一定的影響。綜上所述，依據(jù)研究結(jié)果和西藏地區(qū)生產(chǎn)實(shí)際，將燕麥和紫花苜蓿以7∶3混合青貯，以添加0.4%的乙酸最適宜。

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