宋輝，南志標(biāo)＊，蔡小寧，鐘小仙，顧洪如

（1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京211171；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014）

焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase，EC3.6.1.1）是以焦磷酸為底物的水解酶，該酶廣泛地存在于自然界中，參與合成糖類、核酸和蛋白質(zhì)等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解。PPase通常分為2類，一類是存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器基質(zhì)中的可溶性酶類，即無(wú)機(jī)焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase）；另一類是與膜結(jié)合的不可溶性酶類，也就是膜結(jié)合焦磷酸酶（V－PPase）［1］。植物中主要存在3種質(zhì)子泵（H＋－ATPase），即位于細(xì)胞質(zhì)膜上的P型質(zhì)子泵（P－ATPase）、液泡膜上的V型質(zhì)子泵（V－ATPase）和 H＋－轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶（H＋－PPase）［2］。在鹽脅迫條件下，植物V－H＋－ATPase和V－H＋－PPase一起為液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，將細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na＋區(qū)域化于液泡中，從而減輕Na＋的毒害［3］。

20世紀(jì)50年代，Kunitz［4］首次從酵母中純化到無(wú)機(jī)焦磷酸酶，隨后，Karlsson［5］從甜菜（Betavulgaris）根的膜制劑中分離到鉀激活的V－PPase。但是，直到1992年，Sarafian等［6］才從擬南芥（Arabidopsisthaliana）的cDNA文庫(kù)中第一次克隆出完整的液泡膜H＋－PPase的cDNA序列，命名為AVP1（M81892）。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)陸生植物H＋－PPase cDNA含有2283～2319個(gè)核苷酸的開放閱讀框架（ORF），編碼大約761～722個(gè)氨基酸殘基，計(jì)算出的分子量約為80～81kDa。另外，研究者比較了11種不同陸生植物的液泡膜H＋－PPase氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，它們的同源性高達(dá)86%～91%［7－8］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，液泡膜H＋－PPase是由單基因編碼，它的過(guò)量表達(dá)很有可能會(huì)增加質(zhì)子力而提高植物的耐鹽性。異源表達(dá)擬南芥液泡膜H＋－PPase恢復(fù)了鹽敏感酵母突變體的耐鹽性，鹽芥的液泡膜TsVP轉(zhuǎn)入陸地棉（Gossypiumhirsutum）后使其比同型野生型植株在150和250 mmol/L NaCl處理下耐受性增強(qiáng)［9－10］。席杰軍等［11］和 Wu等［12］成功地從多漿旱生霸王（Zygophyllumxanthoxylum）中克隆了液泡膜H＋－PPase并證實(shí)該基因?qū)Π酝蹴憫?yīng)鹽堿和干旱脅迫具有重要作用。

海濱雀稗（Paspalumvaginatum）又名夏威夷草，隸屬于禾本科雀稗屬植物，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶濱海地帶。海濱雀稗分蘗密度高，生長(zhǎng)旺盛，具有較強(qiáng)的抗逆性和廣泛適應(yīng)性，耐鹽堿的性能尤為出眾，可以使用海水澆灌。因此，筆者認(rèn)為，從海濱雀稗中克隆出相應(yīng)的耐鹽基因，然后將目的基因轉(zhuǎn)入非鹽生牧草中以提高其耐鹽性是可行的。

1 材料與方法

1.1 材料

海濱雀稗于2011年6月份在溫室中培養(yǎng)；大腸桿菌（Escheriachiacoli）DH5α；BU－SuperScript RT KIT、IPTG和X－Gal購(gòu)自Biouniquer；pMDTM18－T Vector購(gòu)自TaKaRa；Phusion High－Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自NEB（北京）有限公司；膠回收試劑盒，Marker購(gòu)自北京天根生化；RNA提取試劑盒，加A反應(yīng)液購(gòu)自蓋寧生物科技（北京）有限公司，引物合成和序列測(cè)定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 海濱雀稗總RNA的提取

依據(jù)RNA pure超純總RNA快速提取試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 海濱雀稗中間片段的克隆

將提取的總RNA使用BU－SuperScript RT KIT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，P1：GGYGGDTCBTCHATGGCYCT，P2：AYTTCTTDGCRTTRTCCC為引物進(jìn)行PCR。將目的片段回收純化，送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 海濱雀稗PvVP15′RACE的克隆

按照Biouniquer的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行，略加修改，先合成5′－RACE－Ready cDNA。根據(jù)所獲得的海濱雀稗液泡膜H＋－PPase基因部分cDNA序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物GSP1：5′－AGAGACCAACCGCCACACACAAGAACA－3′；再設(shè)計(jì)1個(gè)5′端巢式PCR引物 GSP2：5′－GAGCAGCACAAGACGATTCAGCA－3′。通過(guò)2次PCR獲得5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下條帶提取純化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 序列分析

將5′RACE擴(kuò)增得到的片段連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆子，提交南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAstar、ContigExpress、Clustal x、MEGA4.0和NCBI網(wǎng)站上的BLAST比對(duì)工具分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海濱雀稗RNA的提取和鑒定

提取海濱雀稗葉片的總RNA，經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，可清晰觀察到，28SrRNA與18S rRNA的條帶亮度基本呈1∶1。結(jié)果顯示，提取的海濱雀稗總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求（圖1）。

圖1 海濱雀稗總RNA的提取與鑒定Fig.1 Extraction and identification of P.vaginatumRNA

2.2 海濱雀稗PvVP1中間片段的擴(kuò)增

以海濱雀稗cDNA為模板，P1，P2為引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。電泳顯示在1391bp存在一條明顯的亮帶，命名為PvVP1（圖2）。

2.3 海濱雀稗PvVP1 5′RACE的擴(kuò)增

使用5′RACE巢式PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。由圖3可知，在500和750bp之間有一條明亮的條帶。經(jīng)測(cè)序可知，目標(biāo)條帶序列長(zhǎng)697bp。

2.4 海濱雀稗PvVP1 5′RACE序列的分析

通過(guò)對(duì)海濱雀稗PvVP1中間片段和5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物序列的測(cè)定，經(jīng)序列拼接（圖4），該片段ORF核苷酸序列長(zhǎng)1605bp，共編碼535個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)BLAST對(duì)比發(fā)現(xiàn)：海濱雀稗PvVP1的核苷酸序列與玉米（Zeamays）相應(yīng)基因的核苷酸序列同源性達(dá)到93%，而與其他植物的相關(guān)序列同源性也達(dá)到79%以上，與玉米氨基酸的同源性高達(dá)99%。

圖2 海濱雀稗PvVP1中間片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of P.vaginatummiddle fragment

圖3 巢式PCR電泳結(jié)果Fig.3 The nested PCR products

圖4 核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

將通過(guò)推測(cè)得到的PvVP1氨基酸序列與其他植物的氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖5），它與其他植物的氨基酸的保守區(qū)域多達(dá)495個(gè)，而不保守區(qū)域?yàn)?0個(gè)。其中，與大麥（Hordeumvulgare）和水稻（Oryzasativa）的相似性為98%，與小麥（Triticumaestivum）的相似性為97%，與卡拉草（Leptochloafusca）和高粱（Sorghumbicolor）的相似性為95%。

通過(guò)使用MEGA 4.0構(gòu)建PvVP1的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖6），海濱雀稗PvVP1與玉米的親緣關(guān)系最近，與水稻的親緣關(guān)系次之，與萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）和鹽藻（Dunaliellaviridis）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 PvVP1氨基酸序列與其他植物H＋－PPase氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.5 The alignment of the amino acid sequence of PvVP1and H＋－PPase from other plants

3 討論

植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，逐漸形成了通過(guò)減少鹽分的攝入、增強(qiáng)鹽分的外排或使Na＋區(qū)域化進(jìn)入液泡而避免鹽害的脅迫［13］。目前，研究者主要利用以上3種機(jī)制來(lái)增強(qiáng)陸地棉［10］、水稻［14］、煙草［15］（Nicotianatabacum）等經(jīng)濟(jì)作物的耐鹽性，而在牧草方面的研究鮮見報(bào)道。近年來(lái)，隨著草地退化的趨勢(shì)日益嚴(yán)重，生態(tài)環(huán)境的惡化日漸突出，為了改善生態(tài)條件和提高鹽堿地區(qū)城鄉(xiāng)的綠化以及選育優(yōu)良的牧草顯得越來(lái)越重要［16－17］。我國(guó)的研究者在此方面做出了巨大的貢獻(xiàn)，尤其是在結(jié)縷草［18］（Zoysiajaponica）、象草［19］（Pennisetumpurpureum）、狗牙根［20］（Cynodondactylon）等方面的研究已具有一定的影響力，但是利用基因工程的手段研究海濱雀稗的報(bào)道較少。2009年，鄒軼等［21］通過(guò)研究海鹽脅迫對(duì)海濱雀稗生長(zhǎng)的影響表明，海濱雀稗對(duì)鹽脅迫有較強(qiáng)的抗性。正是基于此研究，筆者認(rèn)為，海濱雀稗的較強(qiáng)耐鹽性很有可能是由體內(nèi)的某些基因的上調(diào)表達(dá)造成的。因此，本實(shí)驗(yàn)室試圖利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)海濱雀稗的耐鹽基因進(jìn)行挖掘，以期通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將海濱雀稗良好的耐鹽基因轉(zhuǎn)化耐鹽性較差的牧草中，最終培育出適合在鹽堿地生長(zhǎng)的牧草。

圖6 海濱雀稗PvVP1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of PvVP1

目前普遍將液泡膜H＋－PPase基因分為2種類型，即I型和II型［22－23］。在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，這2種類型的相似性只有36%，而且這2種類型的H＋－PPase基因不是簡(jiǎn)單的同工酶關(guān)系，它們分布在液泡膜的不同部位，發(fā)揮不同的生理功能［24］。目前的研究表明，I型基因在植物的耐鹽性中發(fā)揮重要的作用。本研究利用5′RACE技術(shù)快速克隆了海濱雀稗液泡膜H＋－PPase基因，通過(guò)氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與其他植物I型基因的氨基酸序列非常相似，說(shuō)明所得到的克隆是液泡膜H＋－PPase基因家族I類型。

在綠色植物和藻類植物的液泡膜H＋－PPase基因中保守的GGG、KAADVGADLVGKVE、DNVGDNVGD、YYTS等基序在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中一直未丟失，這被認(rèn)為是液泡膜 H＋－PPase酶的催化位點(diǎn)［7，25－26］。由于DVGADLVGKVE和DNVGDNVGD具有Gly（G）、Ala（A）、Asp（D）、Val（V）四種保守的氨基酸，因此這2種保守的基序不僅在進(jìn)化上具有重要的意義；而且在液泡膜H＋－PPase酶發(fā)揮生理功能時(shí)，也起著非常重要的作用［26］。本試驗(yàn)已成功地克隆到了上述4個(gè)保守的基序（圖4），這表明海濱雀稗PvVP1具有液泡膜質(zhì)子泵的功能。由前人的研究表明，液泡膜H＋－PPase基因I型受 Mg2＋和K＋的激活［7］，并且Asp（D）和Glu（G）被認(rèn)為是最佳的金屬離子螯合位點(diǎn)［27］。因此，筆者推測(cè)，DVGADLVGKVE和DNVGDNVGD這2個(gè)最為保守的基序最有可能是海濱雀稗PvVP1與Mg2＋和K＋的結(jié)合位點(diǎn)和發(fā)揮生理功能的催化位點(diǎn)。

通過(guò)以上對(duì)海濱雀稗PvVP1 5′末端序列的分析，筆者認(rèn)為，海濱雀稗PvVP1具有良好的耐鹽性。本實(shí)驗(yàn)室已準(zhǔn)備下一步克隆海濱雀稗PvVP1的3′末端，從而克隆出PvVP1的全長(zhǎng)序列用于轉(zhuǎn)化優(yōu)良牧草，以提高其耐鹽性。

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