吳莉芳，邢秀蘋，賴紅娥，楊歡歡，秦貴信，楊 婳

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2 廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司，福建 廈門 361012)

大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中可引起人和動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的一些大分子蛋白質(zhì)或糖蛋白。主要包括大豆疏水蛋白、大豆殼蛋白、大豆抑制蛋白、大豆空泡蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、2S白蛋白等[1]。早在1934年，Duke提出大豆蛋白對人具有致敏性，通常表現(xiàn)為顫抖、咽喉水腫、皮疹和急性哮喘等癥狀[2]。隨后，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)含有大豆及大豆制品的日糧可導(dǎo)致鼠[3]、犢牛[4]、仔豬[5]等幼齡動物發(fā)生過敏反應(yīng)，引起小腸絨毛萎縮、脫落，隱窩細胞增生，進而導(dǎo)致消化吸收障礙、生長受阻和過敏性腹瀉等。另外，研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白能夠破壞虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[6-9]等魚類腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸細胞結(jié)構(gòu)，并且使其發(fā)生病理性變化。這些現(xiàn)象被歸因于大豆蛋白中含有的抗原蛋白。隨著大豆及其制品在人類食品和動物飼料中的廣泛應(yīng)用，由大豆所致的過敏現(xiàn)象引起了營養(yǎng)學(xué)家的密切關(guān)注。大豆球蛋白(Glycinin)是免疫原性較強的大豆抗原蛋白，能夠引起魚類消化道過敏反應(yīng)，造成胃、腸道的免疫損傷，進而引起消化吸收障礙，甚至死亡。鯉魚(Cyprinuscarpio)是我國目前主要養(yǎng)殖的淡水經(jīng)濟魚類之一。張錦秀等[10]研究了去皮豆粕對幼建鯉生長性能和腸道的影響。郭林英[11]利用大豆β-伴球蛋白提取物對鯉腸上皮細胞增殖及其功能的影響進行了研究。目前，關(guān)于大豆抗原蛋白Glycinin對鯉魚不同發(fā)育時期腸道組織的影響，尚未見系統(tǒng)報道。為此，本研究分別以鯉稚魚和幼魚為試驗對象，將分離純化的大豆抗原蛋白Glycinin以不同比例添加在其配合飼料中，探討大豆抗原蛋白Glycinin對不同發(fā)育時期鯉魚腸道組織的影響，旨在為合理開發(fā)利用大豆蛋白源及大豆抗原蛋白的去除提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大豆抗原蛋白Glycinin的獲得

本試驗在鯉稚魚和幼魚配合飼料中添加的大豆抗原蛋白Glycinin是在實驗室采用簡化膜中間試驗方法[12]獲得。較好地去除了大豆中其他抗原蛋白的干擾，Glycinin的純度達到85%以上。

1.2 飼料的制備

試驗飼料以魚粉為動物蛋白源，混合油脂(m(玉米油)∶m(魚油)=1∶1)為脂肪源，糊精、面粉作為飼料糖源，分別配制Ⅰ～Ⅴ5組等氮(鯉稚魚和幼魚飼料粗蛋白含量分別約為400和360 g/kg)等能(總能分別約為16.9和15.2 MJ/kg)試驗飼料，其Glycinin的添加梯度分別為0(對照)，30，60，90和120 g/kg。將各原料粉碎過孔徑0.246 mm的篩，按配方準確稱其質(zhì)量，用電動絞肉機制成粒徑1.5和2.5 mm顆粒飼料。曬干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ｕ幹婶~、幼魚試驗飼料組成及營養(yǎng)成分見表1和表2。

表1 鯉稚魚飼料配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 鯉幼魚飼料配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗魚及飼養(yǎng)管理

本次飼養(yǎng)試驗在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物室控溫單循環(huán)系統(tǒng)中進行，試驗前預(yù)飼15 d，飽食投喂對照組飼料，預(yù)飼試驗結(jié)束后挑選規(guī)格整齊、鰭鱗完整、體質(zhì)健壯、無畸形，體質(zhì)量(10.12±0.08) g的鯉稚魚450尾、體質(zhì)量(116.89±0.13) g的鯉幼魚300尾，分別隨機放養(yǎng)在15個水族箱中(鯉稚魚每箱30尾，鯉幼魚每箱20尾)。放養(yǎng)前用20 mg/L高錳酸鉀水溶液藥浴10 min，隨機選擇3個水族箱作為一個試驗組。每天投餌2次(上午09:00，下午16:00)，投餌方式為人工手撒，日投餌率為魚體質(zhì)量的3%～5%，每天記錄每個水族箱攝食飼料質(zhì)量。在整個試驗過程中，水質(zhì)保持穩(wěn)定，水溫24～26 ℃，溶解氧5.0～8.0 mg/L，氨氮指標小于0.3 mg/L，養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。

1.4 樣品的采集與切片的制作

飼養(yǎng)試驗結(jié)束前停食24 h后，從每個處理組隨機取魚30尾，測量體長、終末體質(zhì)量、腸長、腸質(zhì)量，另從每缸隨機取魚3尾，活體解剖，觀察腸道形態(tài)，去除腸道脂肪，用6.5 g/L生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，迅速取前腸、中腸、后腸1.0 cm×1.0 cm組織，釘在標記好的小紙片上，快速用體積分數(shù)4%的中性甲醛固定液固定腸段。按常規(guī)組織切片制備程序進行修塊與沖洗、脫水與透明、透蠟、包埋、切片和H-E染色，細胞核被蘇木精染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染成粉紅色，進行腸道微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和皺襞高度測量。使用Olympus攝影顯微鏡進行圖像采集，用Image-pro Plus 5.02軟件對各魚種前腸、中腸、后腸的皺襞高度進行測量。腸道指標計算公式如下：腸體指數(shù)=腸質(zhì)量/體質(zhì)量，腸長指數(shù)=腸長/體長。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。采用SPSS (17.5)軟件對所有指標進行方差分析，若方差分析顯著，進一步進行LSD和Duncan’s多重比較，分析組間差異顯著性。顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚和幼魚腸道組織的影響

大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚和幼魚腸道組織的影響見表3和表4。

表3 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚腸道組織的影響

表4 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉幼魚腸道組織的影響

由表3可知，在本試驗條件下，大豆抗原蛋白Glycinin的添加量為30，60，90和120 g/kg組(Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ組)鯉稚魚終末體質(zhì)量、中腸和后腸皺襞高度顯著低于對照組(Ⅰ組)(P<0.05)，而前腸皺襞高度、腸質(zhì)量、腸長、腸體指數(shù)和腸長指數(shù)在各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4表明，隨著大豆抗原蛋白Glycinin添加量的增加，鯉幼魚前腸、中腸和后腸皺襞高度呈下降趨勢。大豆抗原蛋白Glycinin的添加量為60，90和120 g/kg組(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ組)鯉幼魚終末體質(zhì)量、后腸皺襞高度、腸質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.05)；而Glycinin的添加量為120 g/kg組的腸長和腸長指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)；腸體指數(shù)、前腸和中腸皺襞高度在各組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚和幼魚腸道形態(tài)的影響

由圖1可知，對照組鯉稚魚腸道絨毛和紋狀緣排列整齊，黏膜下層較薄并且肌層較厚，皺襞間質(zhì)較窄。30 g/kg Glycinin添加組鯉稚魚腸道形態(tài)與對照組沒有明顯差異；60 g/kg Glycinin添加組鯉稚魚腸絨毛開始出現(xiàn)局部斷裂或破損；90和120 g/kg Glycinin添加組鯉稚魚腸道組織形態(tài)進一步被破壞，中腸和后腸受到Glycinin的影響較嚴重。

圖2表明，對照組鯉幼魚腸道絨毛和紋狀緣排列整齊，黏膜下層較薄并且肌層較厚，皺襞間質(zhì)較窄。30 g/kg Glycinin添加組鯉幼魚腸道組織形態(tài)受到Glycinin的影響不明顯；60 g/kg Glycinin添加組鯉幼魚肌層開始出現(xiàn)變薄的現(xiàn)象；90和120 g/kg Glycinin添加組鯉幼魚腸道形態(tài)受到Glycinin的影響較明顯，絨毛出現(xiàn)斷裂或者缺失。

圖1 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚腸道形態(tài)的影響(100×)

圖2 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉幼魚腸道形態(tài)的影響(100×)

3 討 論

3.1 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚和幼魚腸道皺襞高度的影響

魚類的腸道是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，也是魚類最大的黏膜免疫器官和最脆弱的免疫屏障。腸道通常是魚類感染疾病的主要途徑之一。腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)正常是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和動物正常生長的生理基礎(chǔ)， 腸道皺襞高度降低意味著腸道的吸收面積減小，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力降低。在本試驗條件下，大豆抗原蛋白Glycinin的添加量為30，60，90和120 g/kg組鯉稚魚中腸和后腸皺襞高度顯著低于對照組(P<0.05)；大豆抗原蛋白Glycinin的添加量為60，90和120 g/kg組的鯉幼魚后腸皺襞高度顯著低于對照組(P<0.05)。關(guān)于大豆抗原蛋白Glycinin對魚類腸道皺襞高度的影響，國內(nèi)外鮮有報道，大多數(shù)研究針對大豆蛋白源。張錦秀等[10]研究報道，當(dāng)飼料中去皮豆粕(DSBM)替代50%魚粉蛋白后，幼建鯉前腸和后腸的皺襞高度下降。Baeverfjord等[13]研究報道，與對照組魚粉相比，豆粕引起大西洋鮭(Salmosalar)后腸單褶皺襞高度下降了44.3%，復(fù)合褶皺襞高度下降了21.7%。Van den Ingh等[14]對長期飼喂含全脂大豆(FFSB)和大豆蛋白濃縮物(SBPC)的大西洋鮭的前腸和后腸形態(tài)進行了研究，發(fā)現(xiàn)FFSB組大西洋鮭后腸上皮的微絨毛縮短，前腸形態(tài)與對照組差異不顯著；而SBPC組大西洋鮭前腸和后腸形態(tài)與對照組相比均無明顯異常。孫澤威等[15]報道了大豆抗原蛋白引起犢牛生長性能和腸道吸收能力下降。本研究中，添加Glycinin后，鯉稚魚和幼魚前、中、后腸皺襞高度總體呈下降趨勢，這主要是由于鯉稚魚消化和免疫器官不發(fā)達，消化系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，消化機能不完善，正常的腸道微生態(tài)系統(tǒng)尚未建立，使大量未消化的營養(yǎng)物質(zhì)流入腸道。因此，大豆抗原蛋白也可大量進入腸道，在獲得免疫耐受力之前，經(jīng)過一段過敏時期，引起腸道的損傷。

3.2 大豆抗原蛋白Glycinin對鯉稚魚和幼魚腸道形態(tài)的影響

魚類腸道是消化吸收的重要器官，具有容納、推進、消化飼料以及吸收營養(yǎng)物質(zhì)和免疫等功能。Rumsey等[6]利用ELISA法檢測飼料中Glycinin和β-Conglycinin含量分別是58.8和34.4 mg/g時，其均可破壞虹鱒前腸和后腸上皮結(jié)構(gòu)及細胞結(jié)構(gòu)。Li 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Glycinin和β-Conglycinin 能引起仔豬、犢牛等動物的腸道過敏，造成腸道損傷、絨毛萎縮、腺窩增生、腸道消化吸收能力下降。Urán等[17]在鯉魚飼料中添加20%的豆粕替代動物蛋白，1周后鯉魚腸道的大部分指標發(fā)生變化，3周后炎癥反應(yīng)加劇，在第4～5周時鯉魚腸道開始恢復(fù)，核上空泡增加，大部分的指標恢復(fù)正常。Krogdahl等[18]、Refstie等[19]、Ksudhik等[20]分別在大西洋鮭、虹鱒、歐洲真鱸(Dicentearchuslabrax)的飼料中添加一定量的大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白使魚后腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)變化，黏膜褶縮短。本研究通過對鯉稚魚和幼魚腸道微觀結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，在本試驗條件下，大豆抗原蛋白Glycinin的添加量為60 g/kg時，鯉稚魚腸絨毛開始出現(xiàn)局部斷裂或破損；當(dāng)Glycinin添加量為90和120 g/kg時，鯉稚魚腸道組織形態(tài)進一步被破壞，中腸和后腸受到Glycinin的影響較嚴重。當(dāng)Glycinin添加量為60 g/kg時，鯉幼魚肌層開始出現(xiàn)變薄的現(xiàn)象；當(dāng)Glycinin添加量為90和120 g/kg時，鯉幼魚腸道絨毛出現(xiàn)斷裂或者缺失。這主要是由于魚類攝食含有大豆抗原蛋白Glycinin的飼料后，大部分Glycinin被降解為肽和氨基酸。然而由于稚魚和幼魚腸道黏膜屏障發(fā)育不成熟，大豆抗原蛋白Glycinin以完整的大分子形式穿過小腸上皮細胞間或上皮細胞內(nèi)的空隙從而完整地進入血液和淋巴。這些具有抗原活性的大分子物質(zhì)刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起腸道絨毛萎縮，從而使腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

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