吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學院 畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學診斷實驗室，陜西 咸陽 712000)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸傳染性疫病，發(fā)病率和死亡率高，廣泛分布于世界各國，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。CSFV是黃病毒科、瘟病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒。CSFV基因組長度約為12.3 kb，編碼1個獨立的多聚蛋白，自氨基端到羧基端排列順序為Npro-C-E0-E1-E2-P7-NS2.3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[2]。多聚蛋白被宿主蛋白酶修飾后可轉(zhuǎn)變成不同的成熟蛋白，在這些蛋白中，E0蛋白能誘導機體產(chǎn)生中和性抗體，也是CSFV感染細胞后惟一可以分泌到細胞培養(yǎng)上清液中的糖蛋白[3]。研究發(fā)現(xiàn)，E0蛋白具有RNA酶活性，且E0可能是導致病毒持續(xù)感染宿主的重要原因[4]。由于豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)有重要影響，多年來發(fā)展出了多種豬瘟診斷技術(shù)，在病原診斷上主要有免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫膠體金技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，其中以RT-PCR技術(shù)最為敏感，是現(xiàn)代診斷重點技術(shù)之一[5-6]。CSFVE0基因相對保守，是CSFV分子診斷的重要候選基因。長期以來，我國在豬瘟防控上一直堅持疫苗免疫為主的策略，但隨著時間的推移，許多學者發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒已經(jīng)發(fā)生了變異，并懷疑豬瘟流行形勢的變化與基因變異有關[7-8]。因此，本研究擬建立一種RT-nPCR擴增E0基因的檢測方法，同時進行E0序列分析，以期為臨床提供一種快速、靈敏、特異的診斷手段，并通過序列分析了解CSFV分子衍化情況，為豬瘟防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 毒 豬瘟病毒參考株為疫苗毒株，參照毒株牛病毒性腹瀉黏膜病病毒(BVDV)XY08株、藍耳病病毒(PRRSV)CH-1R株、圓環(huán)病毒(PCV-2)SD06株、偽狂犬病毒(PRV) Bartha-K61株、細小病毒(PPV)ZJ05株為疫苗毒或分離毒株，均由咸陽職業(yè)技術(shù)學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病分子生物學診斷實驗室保存。

1.1.2 組織病料 疑似豬瘟組織病料由動物疫病分子生物學診斷實驗室采集，共計32份，分別來自咸陽市(11份)、西安市(5份)、寶雞市(9份)、渭南市(5份)和漢中市(2份)豬場。組織病料包括脾臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)和扁桃體，研磨處理后，12 000 r/min 高速離心10 min，取上清液于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 TRIzol Reagent為Invitrogen公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、DEPC處理水、rTaq酶、dNTP、EcoRⅠ、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司；pMD18-T載體克隆試劑盒、BamHⅠ及Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；DH5α大腸桿菌由動物疫病分子生物學診斷實驗室保存。

1.1.4 引物設計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬瘟病毒HCLV株(GenBank登錄號：AF531433)、Shimen株(GenBank登錄號：AF092448)全基因序列，設計2對引物，采用RT-nPCR方法擴增E0基因，引物序列如下，E0-1F：5′-AACCACCAGAATCTAGGAAG-3′，E0-1R：5′-GTGTTTTTGGGGAGGCAAGC-3′；E0-2F：5′-AAAGCCCTATTGGCATGGG-3′，E0-2R：5′-GGTGCAGTTGTTAGTGTACC-3′。預期擴增片段801 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，用DEPC處理水溶解，終濃度為25 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 CSFV總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取CSFV疫苗毒250.0 μL，用TRIzol Reagent提取總RNA，空氣中自然干燥。RNA干燥過程中，配制反轉(zhuǎn)錄反應液，組成為：DEPC處理水12.5 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，dNTP 2.0 μL，下游引物E0-1R(10 μmol/L)1.0 μL， AMV 0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.25 μL，總體積20.0 μL。待RNA干燥后用配制好的反轉(zhuǎn)錄反應液充分溶解，4 000 r/min瞬時離心5 s，置42 ℃水浴反轉(zhuǎn)錄90 min，取出后立即冰浴，用微量紫外分光光度計測定cDNA濃度。

1.2.2 CSFV RT-nPCR檢測方法的建立 以已知濃度的cDNA溶液作為模板，摸索擴增條件。第1次擴增反應體系中，cDNA 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，E0-1F、E0-1R(10 μmol/L)各0.5 μL，改變rTaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，用超純水補足25.0 μL。條件設定為95 ℃預變性5 min；進入循環(huán)后94 ℃ 50 s變性，退火溫度由52 ℃至58 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2次擴增反應體系中，取2.0 μL第1次擴增產(chǎn)物作為模板，體系及條件同第1次擴增，引物為E0-2F、E0-2R。摸索出反應體系和反應條件的最佳組合。

1.2.3 RT-nPCR方法的靈敏度試驗 將已知濃度的cDNA溶液做10倍梯度稀釋，按照摸索出的最優(yōu)體系與條件進行RT-nPCR反應，取5.0 μL第2次擴增產(chǎn)物，進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中照相觀察。

1.2.4 RT-nPCR方法的特異性試驗 提取CSFV、PRRSV、BVDV等RNA病毒的核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；按照DNAzol Reagent試劑說明提取PCV-2、PRV和PPV等DNA病毒的DNA模板，用E0-1F/E0-1R、E0-2F/E0-2R引物對分別進行第1次和第2次擴增，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.5 病料中E0基因的PCR擴增 用以上建立的檢測方法對收集的32份組織病料進行檢測。選取不同地區(qū)E0基因陽性PCR產(chǎn)物，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增條帶，與pMD18-T載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp+平板篩選，挑取單個菌落，搖動培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定。提取陽性菌質(zhì)粒，進行BamH Ⅰ及Hind Ⅲ雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.2.6E0基因序列及推導氨基酸序列的比對分析 用DNAstar軟件，將獲得的8株豬瘟病毒E0基因序列與GenBank中發(fā)表的ALD(登錄號D49532)、Alfort187(X87939)、Brescia(AF091661)、C HVRI(AY805221)、GXWZ02(AY367767)、HCLV(AF531433)、Paderborn (AY072924)、Rimes(AY259122)和Shimen(AF092448)等國內(nèi)外豬瘟代表毒株，進行核苷酸和氨基酸同源性比對分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSFV RT-nPCR檢測方法的建立

通過改變反應體系中rTaqDNA聚合酶用量和Mg2+用量，改變反應條件中的退火溫度，優(yōu)化反應體系和反應條件，最終確定最優(yōu)體系和條件為：第1次擴增cDNA 2.0 μL，超純水16.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL，dNTP 1.0 μL，E0-1F、E0-1R(10 μmol/L)各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶 0.25 μL，總體積25.0 μL。條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2次擴增時，取2.0 μL第1次擴增產(chǎn)物作為模板，體系同第1次擴增，引物為E0-2F/E0-2R。條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2.2 CSFV RT-nPCR檢測方法的靈敏度

測定反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA含量為670 ng/L，10倍梯度稀釋后進行套式擴增。從圖1可見，用所建立的方法能夠擴增出可見目的條帶的最大稀釋度為107，即檢測的cDNA含量極限為6.7×10-5ng/L，表明此方法靈敏度高，完全滿足CSFV臨床檢測需要。

2.3 CSFV RT-nPCR檢測方法的特異性

用所建立的方法對CSFV、PRRSV、BVDV、PCV-2、PRV和PPV陽性毒進行擴增，結(jié)果只有CSFV擴增出了801 bp的目的條帶(圖2)，與預期條帶長度一致，其他5種毒均未擴增出條帶，提示所建立的方法特異性較好。

圖1 CSFV E0基因 RT-nPCR檢測方法的靈敏度

2.4 疑似病料的CSFV檢測

用建立的RT-nPCR方法，檢測采集的陜西省部分地區(qū)32份疑似豬瘟的淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟和扁桃體等組織病料，結(jié)果有12份病料呈現(xiàn)陽性，陽性率為37.5%，部分病料檢測結(jié)果見圖3。

2.5 E0基因序列的測定

選取陜西不同地區(qū)8株CSFV毒株的E0克隆基因，回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后提取陽性質(zhì)粒，經(jīng)BamH Ⅰ及Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得一個完整的801 bp片段或538 bp和263 bp 2個小片段，原因是部分E0基因中存在Hind Ⅲ酶切位點(圖4)。測序后獲得8株CSFV流行毒株E0基因序列，分別命名為SXXY01-E0、SXXY02-E0、SXBJ01-E0、SXWN01-E0、SXWN02-E0、SXXA01-E0、SXXA02-E0和SXHZ01-E0。

圖3 部分疑似CSF病料中CSFV E0基因的檢測

2.6 E0基因及推導氨基酸序列的比對分析

將獲得的8株E0基因核苷酸序列、推導氨基酸序列與9株參考毒株進行比對分析，同源性見表1，系統(tǒng)發(fā)生樹見圖5。

從表1可以看出，8株CSFV流行毒株E0核苷酸及其編碼氨基酸同源性最高的是SXXA02-E0與SXHZ01-E0，分別為99.3%和98.5%，最低的是SXXY01-E0與SXWN02-E0，分別為97.0%和94.8%，其他各株間的同源性介于此范圍內(nèi)；這8個流行毒株之間的同源性較高。與參考毒株相比，核苷酸同源性最高的是SXXA02-E0與GXWZ02，為95.4%， 最低的是SXWN02-E0與HCLV，為83.4%；氨基酸同源性最高的仍為SXXA02-E0與GXWZ02，為98.1%，最低的是SXXA01-E0與Rimes，僅為85.8%。

表1 不同CSFV毒株E0核苷酸、氨基酸序列同源性比對

從進化樹(圖5)可以看出，所有比對毒株分為2大基因群， HCLV、Rimes、Shimen、ALD、Alfort187、Brescia和C HVRI形成一個大的分支，為基因Ⅰ群；而本研究獲得的8個(CSFV)流行毒株與GXWZ02、Paborn形成另一個大的分支，為基因Ⅱ群。

圖5 CSFV流行毒株與參考毒株E0基因的系統(tǒng)發(fā)生樹

E0蛋白中，氨基酸基序SLHGIWPE和EWNKHGWC具有Rnase活性，分別定位于第47～54位和第94～101位(圖6)。比較發(fā)現(xiàn)，8個CSFV流行毒株E0蛋白的SLHGIWPE基序相同，與參考毒株相比，第54位的氨基酸大多數(shù)為E，但C HVRI、HCLV和Rimes 3個疫苗株均為G(圖6左)。EWNKHGWC基序比較發(fā)現(xiàn)，除SXWN02第94位由E變異為K外，其他毒株均未發(fā)生任何變異(圖6右)。

圖6 CSFV E0蛋白2個Rnase活性區(qū)域的氨基酸序列比較

3 討 論

豬瘟是豬群重大疫病之一，其快速診斷方法的建立對于防控豬瘟具有重要作用。目前診斷豬瘟的主要方法有熒光抗體染色、兔體中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫膠體金技術(shù)和RT-PCR等技術(shù)。在這些方法中，RT-PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點，適合大批量檢測。許多學者也針對CSFV的不同基因建立了RT-PCR診斷方法，主要針對E2、NS5B、3′-UTR等區(qū)域[9]。本研究選取E0作為靶基因，建立了CSFV的RT-nPCR檢測方法，原因是E0基因相對保守，便于擴增，并且擴增產(chǎn)物可直接進行回收測序，對研究E0基因的變異有重要意義。試驗表明，所建立方法檢測cDNA含量的極限為6.7×10-5ng/L，在常見的豬群疫病病毒中僅有CSFV可擴增出特異性條帶，提示建立的方法靈敏度高、特異性好。

應用所建立的方法對采集的陜西省部分地區(qū)32份疑似豬瘟病料進行檢測發(fā)現(xiàn)，有12份病料呈現(xiàn)陽性，陽性率為37.5%，表明所建立的方法能夠很好地檢測組織病料。此外，本試驗結(jié)果顯示，在陜西部分豬場豬瘟感染強度仍然較高，豬瘟仍是豬場防控的重點疫病，這一結(jié)果與其他學者近年的研究觀點[10]相似。

近年來，豬瘟免疫失敗的報道屢見不鮮，有許多研究認為，CSFV在長期免疫壓力下基因變異是導致這一現(xiàn)象的原因之一[11-12]。E0蛋白具有Rnase活性，與病毒持續(xù)感染機體有直接關系，因而研究E0基因的變異趨勢有重要意義[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，測定的8株流行毒株E0基因與我國疫苗毒株HCLV、C HVRI的同源性僅為83.4%～85.1%，氨基酸同源性僅為86.1%～89.1%，呈現(xiàn)出較明顯的遠離疫苗株的變異趨勢。E0蛋白中具有Rnase活性的氨基酸基序SLHGIWPE和EWNKHGWC，且8個流行毒株E0蛋白的SLHGIWPE基序相同。不同的是，3個疫苗株C HVRI、HCLV和Rimes第54位的氨基酸均為G，其他毒株均為E，這一變異是否與毒株的毒力有關，尚需進一步研究。比較發(fā)現(xiàn)，除SXWN02株EWNKHGWC基序第94位由E變異為K外，其他毒株均未發(fā)生任何變異。SXWN02株的這一變異為首次發(fā)現(xiàn)，尚未見到相似的公開報道，這一變異對毒株毒力、致病性有何影響，值得深入研究。

總之，本研究建立了一種特異性好、靈敏度高的豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法，并對克隆的E0基因進行了序列分析。以前研究認為，E0蛋白中具有Rnase活性的氨基酸基序高度保守，未發(fā)現(xiàn)變異[4,9-10,14]，但本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rnase活性氨基酸基序的變異現(xiàn)象，值得關注。綜合多位學者的研究成果，CSFV基因變異并逐漸遠離疫苗株已成為普遍現(xiàn)象，且在一些關鍵位點上呈現(xiàn)變異增多的趨勢。這一情況需要引起高度重視，雖然目前疫苗尚能保護豬群[15]，但隨著病毒變異的積累，其后果難以預料。因此，我國需要做好針對流行毒株的新疫苗開發(fā)工作。

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