邱小明，劉志瓊

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棘孢小單孢菌原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

邱小明1，劉志瓊2

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.上海皚博生物科技有限公司，上海 201620)

對棘孢小單孢菌() 原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行了研究，研究表明：將棘孢小單孢菌的孢子接種到種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36～48h（種液變?yōu)槲⒓t色），轉(zhuǎn)接于含有0.3%Gly的抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入終濃度為15mg/ml的溶菌酶，37℃，酶解90min得到優(yōu)化的原生質(zhì)體制備條件，此時(shí)原生質(zhì)體形成率與再生率之積最高，效果最好。

棘孢小單孢；原生質(zhì)體；制備；再生；優(yōu)化。

小單孢菌（）是一類產(chǎn)生多種抗生素的放線菌[1，2]，如臨床上常用的慶大霉素[3]、小諾霉素[4]等。慶大霉素是由絳紅色小單(NRRL 2953)和棘孢小單孢菌(NRRL 2985)產(chǎn)生的一族多組分的氨基糖苷類抗生素[5]。目前慶大霉素產(chǎn)生菌改良的主要措施是菌種誘變，如楊麗[6]等以慶大霉素產(chǎn)生菌JY1-12為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線照射,選育出性能優(yōu)良的菌株JY3-5,比出發(fā)菌株效價(jià)提高18.6%，也有人做了用誘變劑直接誘變小單孢菌的原生質(zhì)體的嘗試，如楊麗[6]以棘孢小單孢突變(JIM-401)為出發(fā)菌株,進(jìn)行原生質(zhì)體制備及再生條件的研究,結(jié)合UV照射及高能電子流誘變,篩選出MS-116菌株,30噸發(fā)酵罐試驗(yàn),其C2b組分達(dá)85.6%。鄭幼霞等[7]在研究棘狀小單孢菌原生質(zhì)體形成，再生和融合重組中發(fā)現(xiàn)，在含有0.3%甘氨酸的培養(yǎng)基中其菌絲形態(tài)有明顯改變，以PEG4000為融合，重組子的效價(jià)為1900ｕ/ml左右，比對照組提高約52％。這些充分顯示了原生質(zhì)體再生和原生質(zhì)體融合在改良小單孢菌方面是一種比較有效的方法。本研究嘗試對棘孢小單孢菌原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化，期望對后續(xù)慶大霉素產(chǎn)生菌的基因工程育種方面提供幫助。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

棘孢小單孢菌JBS)菌株。溶菌酶 生工生物工程（上海）有限公司

1.2 培養(yǎng)基及溶液

（1）棘孢小單孢菌原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 40，蔗糖103，MgCl210，KNO31，K2HPO40.3，MgSO40.5, NaCl 0.5, CaCO31，麩皮30，瓊脂15，pH 7.6～7.8。

（2）棘孢小單孢菌孢子平板培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 10，KNO31，K2HPO40.3，MgSO40.5, NaCl 0.5, CaCO31,天冬素 0.02，瓊脂17，pH 7.6～7.8。

（3）棘孢小單孢菌孢子斜面培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 10，KNO31，K2HPO40.3，MgSO40.5, NaCl 0.5, CaCO31,天冬素 0.02，瓊脂15，pH 調(diào)至 7.6～7.8。

（4）棘孢小單孢菌生長培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 20 ,黃豆餅粉 20 ,蛋白胨5，葡萄糖5，CaCO34，MnSO4.0.0001，CoCl20.001，Gly 3，pH 調(diào)至 7.8，35℃培養(yǎng) 120h，搖床轉(zhuǎn)速 220r/min。

1.3 常用溶液及緩沖液

（1）P緩沖液（原生質(zhì)體制備緩沖液）（g/L）：蔗糖 103，K2SO40.25，MgCl2·6H2O 2.02，微量元素2ml；

（2）微量元素[8]；

（3）T 轉(zhuǎn)化緩沖液（g/L）：蔗糖165，，K2SO40.4，MgSO46H2O 3.4，微量元素3.3ml，將上述四種組分溶于900ml蒸餾水中，使用前加入STE（0.25M）10ml，KH2PO4（0.5％）1.7ml和CaCl2（5M）0.85ml，用0.22μm的濾膜過濾除菌；

1.4 棘孢小單孢菌原生質(zhì)體的制備方法[5]。

1.5 棘孢小單孢菌原生質(zhì)體形成率和再生率的計(jì)算公式為：

A: 酶解前菌絲體直接用無菌水適當(dāng)稀釋涂布平板長出菌落數(shù)；

B: 酶解液經(jīng)無菌水適當(dāng)稀釋后涂布于孢子生長培養(yǎng)基平板長出菌落數(shù)；

C: 酶解液經(jīng)P液適當(dāng)稀釋后涂布于再生平板長出菌落數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 甘氨酸濃度對原生質(zhì)體形成的影響

小單孢菌與其它微生物不同，具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，其肽聚糖中N－乙酰胞壁酸中乙?；涣u乙酰基所取代。所以，溶菌酶不能很好的水解其細(xì)胞壁.甘氨酸則具有滲入細(xì)菌細(xì)胞壁替代肽聚糖中D－丙氨酸的作用，可能影響細(xì)胞壁組份的相互交聯(lián)，并在一定程度上抑制了菌絲體的生長發(fā)育，但細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性卻顯著增強(qiáng)了，使其菌絲體細(xì)胞壁易受溶菌酶溶解，從而釋放出大量的原生質(zhì)體[9].有資料表明[4]，放線菌Gly濃度以0.2-0.4%為宜，為考察Gly濃度對原生質(zhì)體形成的影響，在生長培養(yǎng)基中分別加入0，0.1％，0.2％, 0.3％, 0.4％Gly，培養(yǎng)48小時(shí)后收獲菌體，用15mg/mL溶菌酶，37℃，酶解2h，結(jié)果見圖1所示。由圖可知，在低濃度Gly作用下，原生質(zhì)體的形成率隨著Gly濃度的增加而增加，當(dāng)Gly濃度高于0.3%以上，原生質(zhì)體形成率沒有明顯提高。并且加入0.4% Gly會明顯減少培養(yǎng)基中菌絲的生成量，因此選擇在抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中加入0.3% Gly為最合適。

圖1 不同甘氨酸（Gly）濃度對原生質(zhì)體形成率的影響

2.2 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響

溶菌酶的濃度對原生質(zhì)體的制備與再生至關(guān)重要，不同溶菌酶酶解濃度不僅會影響原生質(zhì)體的形成，還會影響到原生質(zhì)體的再生。在含0.3％Gly的抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h收獲菌體后，分別加溶菌酶濃度為2,5,10,15,20mg/mL，37℃酶解2h，考察溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響，結(jié)果分別如圖2和圖3所示。

圖2 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成率的影響

圖3 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體再生率的影響

由圖2可知，在溶菌酶濃度2mg/ml至15mg/ml范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的形成率隨著酶濃的增加而增加。酶濃為15mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成率為86%，當(dāng)酶濃達(dá)20mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成率卻略有下降，約為79％。由圖3可知，在溶菌酶濃度為2～5mg/mL范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的再生率隨溶菌酶濃度的增加而增加，但當(dāng)溶菌酶濃度超過5mg/mL時(shí)原生質(zhì)體的再生率隨著溶菌酶濃度的增加反而下降。當(dāng)酶濃為20mg/mL時(shí)，再生率下降明顯，僅為3.8%。原因可能是由于原生質(zhì)體再生時(shí)需要?dú)埩舻募?xì)胞壁作為“引物”，隨著酶濃的增大，細(xì)胞脫壁徹底，于是降低原生質(zhì)體的再生率[9]；同時(shí)酶中往往含有對原生質(zhì)體有害的酶類(如過氧化物酶、核糖核酸酶等)，隨著酶量的增加，雜酶的濃度也會隨之增加，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，因細(xì)胞脫壁，雜質(zhì)也易滲進(jìn)細(xì)胞，必然會影響原生質(zhì)體的活性，故此原生質(zhì)體再生困難。綜合溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成率和再生率兩方面的影響，用形成率×再生率來評價(jià)，得出溶菌酶最佳濃度為15mg/mL時(shí)，形成率×再生率為5.6%。

2.3 溶菌酶作用時(shí)間對原生質(zhì)體生成和再生的影響

在含有0.3％Gly的抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48h收獲菌絲，在15mg/ml溶菌酶37℃作用下，棘孢小單孢菌菌體經(jīng)不同時(shí)間酶解對原生質(zhì)體的形成和再生的影響分別如圖4和圖5所示。

圖4 溶菌酶酶解時(shí)間對原生質(zhì)體形成的影響

圖5 溶菌酶酶解時(shí)間對原生質(zhì)體再生的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體形成率隨著酶解時(shí)間的增長而增加。酶解30min時(shí)，原生質(zhì)體形成率約為23%，酶解時(shí)間為90min和120min時(shí)，原生質(zhì)體形成率相差不大，分別為82%和85%;當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)150min時(shí)，原生質(zhì)體形成率反而下降，約為80％。由圖5可知，在溶菌酶作用時(shí)間小于60min時(shí)，原生質(zhì)體再生率隨酶解時(shí)間的增加而增加，但當(dāng)超過60min后隨著作用時(shí)間的增加再生率隨之下降。分析其原因可能是:(1)因?yàn)樵|(zhì)體的再生需要一定細(xì)胞壁的殘余物作為再生“引物”，若原生質(zhì)體的細(xì)胞壁消化太徹底，無助于細(xì)胞壁的再生，使原生質(zhì)體難以再生。（2）溶菌酶作用時(shí)間太長可能會對原生質(zhì)體發(fā)生作用而使細(xì)胞質(zhì)膜受到一定的損傷，增加原生質(zhì)體的再生困難。綜合溶菌酶作用時(shí)間對原生質(zhì)體的形成和再生二方面的影響，用形成率×再生率來評價(jià)，得出溶菌酶最佳酶解時(shí)間為90min，形成率×再生率為6.2%。

2.4 菌齡對原生質(zhì)體形成和再生的影響

原生質(zhì)體的釋放效果與菌絲的生理狀況關(guān)系十分密切,不同生長時(shí)期的菌絲用溶菌酶處理后,在顯微鏡下觀察均可看到含有球狀體(原生質(zhì)體)。選用12h，24h, 36h，48h, 60h，72h菌齡的菌絲體在含有0.3 % Gly的抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中35℃下培養(yǎng)收獲菌絲后，用15mg/mL溶菌酶，37℃，酶解90min，考察菌齡對原生質(zhì)體的形成和再生的影響。

圖6 菌絲體的菌齡對原生質(zhì)體形成的影響

圖7 菌絲體的菌齡對原生質(zhì)體再生的影響

由圖6可知，棘孢小單孢菌原生質(zhì)體形成率在48h最高，達(dá)到82％左右，超過48h后，原生質(zhì)體形成率反而開始下降。由圖7可知，菌絲體的菌齡在60h時(shí)的再生率最高可達(dá)7.9%，48h時(shí)為7.5%。綜合溶菌酶作用時(shí)間對原生質(zhì)體的形成和再生二方面的影響，用形成率×再生率來評價(jià)，得出菌齡為48h對其原生質(zhì)體的形成和再生最有利，形成率×再生率為6.2%。

3 討 論

本文通過考察甘氨酸濃度、溶菌酶濃度、酶解時(shí)間、菌齡對棘孢小單孢菌原生質(zhì)體制備的影響，確定棘孢小單孢菌原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為：棘孢小單孢菌的孢子接種到3 7 ℃的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36～48h（種液變?yōu)槲⒓t色），轉(zhuǎn)接于含有0.3 % Gly的抑制細(xì)胞壁合成培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h，用無菌的P液洗滌，加入終濃度為15mg/ml的溶菌酶，37℃，酶解90min最合適，此時(shí)原生質(zhì)體形成率與再生率之積最高，通過試驗(yàn)優(yōu)化了慶大霉素產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌原生質(zhì)的體制備條件，為后續(xù)棘孢小單孢菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化提供了有效的保障。

[1] Malfait MB, Godden MJ. Pennunckx，Growth and cellulase production of Micromonospora chalcae and Pseudonocardia thermophila[J]. Ann Microbiol (Paris)，1984, 135B:79-89.

[2] Suarez JEC，Barbes C，Hardisson.Germination of spores of Micromonospora chalcae and biochemical changes[J].J Gen Microbiol，1980,121:159-167.

[3] Weinstein MJ, Iuedemann GM, Oden EM, et al. Gentamicin, a new broad-spectrum antibiotic complex[J]. Antimicrob Agents Chemother，1963, 161:1-7.

[4] Kawamura Y,Yasuda Y,Mayama M. Isolation of L-2- (1-methylcyclopropyl) glycine from Micromonospora miyakonensis sp. nov. 1. Taxonomic studies on the producing microorganism [J]. J Antibiot，1981，34(4):367-373.

[5] 戴自英.實(shí)用抗生素[M].上海:上海人民出版社，1977.

[6] 楊麗.慶大霉素產(chǎn)生菌的紫外線誘變育種及發(fā)酵條件研究[J].青島化工學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，20（1）:48-51.

[7] 鄭幼霞，徐小雪，楊佩，等.慶大霉素產(chǎn)生菌棘抱小單孢菌原生質(zhì)體形成、再生及融合重組研究[J].生物工程學(xué)報(bào)，1987, 3 (2):115-118.

[8] Haifeng H, Kozo O. Novel Approach for Improving the Productivity of Antibiotic-Producing Strains by Inducing Combined Resistant Mutations[J].Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(4):1885-1892.

[9] 孫劍秋，周東坡.微生物原生質(zhì)體技術(shù)[J].生物學(xué)通報(bào),2002,37(7):9-11.

（責(zé)任編輯：季平）

The Optimization to The Preparation Conditions of Micromonospora echinospora Protoplast

QIU Xiao-ming1，LIU Zhi-qiong2

（1.Foods and biology engineering department, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou 363000;2.Shanghai Kaibo Biotechnology limited Co., Shanghai 201620）

The preparation conditions of micromonospora echinospora protoplast were studied. The results showed that: the spores of micromonospora echinospora were inoculated into seed medium and cultured for 36 ~ 48h (until seed liquid turned reddish), continued to culture for 48h in an inhibiting cell wall synthesis medium containing 0.3% Gly, then lysozyme with a final concentration of 15mg/m was added. The optimized preparation conditions of protoplast were at 37 ℃ and enzymolysis time of 90min, when the product of protoplast formation rate and regeneration rate was the highest and the result was the best.

micromonospora echinospora; protoplast; preparation; regeneration; optimization

2014－04－18

福建省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（JB12334）

邱小明（1979－），男，江西信豐人，講師，碩士，主要研究方向：生物制藥與生化反應(yīng)工程。

1673-1417（2014）02-0015-06

10.13908/j.cnki.issn1673-1417.2014.02.0003

TQ465

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