趙貝塔，趙 巍，劉鄰渭

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 中國科學(xué)院水利部水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

花青素(Anthocyanin)一詞源于Marguart在1853年對矢車菊花朵中藍(lán)色提取物的命名，是一類物質(zhì)的總稱[1]?；ㄇ嗨仡愇镔|(zhì)為重要的水溶性植物色素，屬于酚類化合物中的類黃酮，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，為多羥基-2-苯基苯并吡喃烊鹽及其糖苷[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)并得到研究的花青素有天竺葵色素(Pelargonidin)、矢車菊素(Cyanidin)、芍藥色素(Peonidin)、飛燕草色素(Delphinidin)、牽牛花色素(Petunidin)和錦葵色素(Malvidin)等6類[3]?；ㄇ嗨爻膳c單糖(如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖)相連形成花色苷外，也可與芳香酸或脂肪酸通過酰化而相連。

花青素類物質(zhì)易溶于水、甲醇、乙醇、稀堿或稀酸等極性溶劑，其顏色隨pH值而變化[4]，是重要的食品色素；此外，花青素類物質(zhì)具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抑制脂質(zhì)過氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病和保護(hù)視力等。但是從植物中分離出的花青素極不穩(wěn)定，易受酸堿度、溫度、自身濃度、光、氧、酶、輔因子、微生物和金屬離子等的影響而降解[5]，從而使其應(yīng)用受到一定程度的限制。因此，鑒定分析花青素的結(jié)構(gòu)和組成是對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性以增強(qiáng)其穩(wěn)定性的前提條件，并且可通過認(rèn)識其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能，進(jìn)而指導(dǎo)新資源的開發(fā)及生產(chǎn)。

目前已發(fā)現(xiàn)的花青素類物質(zhì)有500多種[6]，其多樣性賦予花青素廣泛的生物活性，但同時(shí)也增加了其分析鑒定的難度。目前，常用于花青素類物質(zhì)分析的方法主要有紫外-可見光譜法(UV-Vis spectrum)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、質(zhì)譜技術(shù)(Mass spectrometry,MS)、核磁共振波譜法(Nuclear magnetic resonance,NMR)、紙層析法(Paper chromatography,PC)、薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(Performance capillary electrophoresis,PCE)、紅外吸收光譜法(Infrared spectroscopy,IR)和近紅外吸收光譜法(Near infrared spectrum,NIR)等，這些方法均有各自的優(yōu)勢和局限性。本文對花青素類化合物主要分析方法的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了評述，以期進(jìn)一步明確各種分析方法的應(yīng)用范圍和功能，為今后開展花青素類化合物的分析研究提供支持。

1 紫外-可見光譜法

1.1 紫外-可見光譜法表征花青素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)

自從1958年Harborne[7]將紫外-可見光譜法應(yīng)用于花青素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定以來，至今已形成一系列確定花青素類化合物結(jié)構(gòu)官能團(tuán)的紫外-可見光譜法(表1[8])。

表1 紫外-可見光譜法在花青素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

花青素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定最初主要依靠紫外-可見光譜法，但該方法局限性很大。首先，不同的溶劑體系，其紫外-可見光譜也有所不同，無法建立一種普遍適用的方法；其次，該方法對純物質(zhì)鑒定效果較好，而花青素的粗提物往往有較多的雜質(zhì)，很難準(zhǔn)確鑒定其結(jié)構(gòu)，常出現(xiàn)誤判情況。質(zhì)譜、核磁共振以及聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展使得各種復(fù)雜花青素的結(jié)構(gòu)鑒定有了更加可靠和準(zhǔn)確的方法。

1.2 紫外-可見光譜法測定花青素類化合物的總量

1976年Wrolstad建立了紫外-可見光譜測定花青素總量的方法[9]，該法包括單一pH法[10]、pH示差法[11]和差減法[12]，其方法操作簡單、成本低，現(xiàn)今仍然被廣泛應(yīng)用。

1.2.1 單一pH法 在新鮮的植物提取物中很少含有與花青素類物質(zhì)有相同最大吸收光波區(qū)的干擾物，因此其總量可基于朗伯-比爾定律選取適當(dāng)波長來測定，其測定過程需要在一定pH值的介質(zhì)中進(jìn)行，并確定樣品中最具有代表性的花青素類物質(zhì)在所選吸收波長處的摩爾消光系數(shù)ε或比消光度E。我國學(xué)者利用該方法測定了玫瑰花[13]、黑豆皮[14]、茶樹芽葉[15]、葡萄酒[16]、紫色馬鈴薯[17]等的花青素類物質(zhì)含量。但綜合分析可知，該方法僅適用于干擾物含量低的體系。

1.2.2 pH示差法 pH示差法是2005年美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)指定的花青素總含量測定方法，是目前國內(nèi)外應(yīng)用最為普遍的方法[18]。該方法的依據(jù)是pH值的改變可影響花青素的色調(diào)和色度，而不影響干擾物質(zhì)的特征光譜；根據(jù)朗伯-比爾定律，試樣溶液在2個(gè)不同pH值下的吸光度差值與花青素的總含量成正比[19]。該方法可以較好地減小干擾物質(zhì)的影響，但由于輔色素轉(zhuǎn)化不完全，因此實(shí)測含量一般低于理論含量[20]。Grisebach[21]選擇1.0和4.5共2個(gè)pH值對花青素進(jìn)行了定量分析，當(dāng)溶液pH值為1.0時(shí)，花青素在510 nm處有最大吸收；而當(dāng)溶液pH值為4.5時(shí)，花青素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色查爾酮，在510 nm處無吸收，因而可用示差法計(jì)算溶液中的花青素總含量，其計(jì)算公式為：

式中：C為花青素的含量(g/L)；ApH1.0、ApH4.5分別為溶液在pH為1.0和4.5時(shí)的吸光度；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，其值為449；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，其值為29 600。

pH示差法可降低非花青素類物質(zhì)的干擾，在缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，可直接利用公式計(jì)算。

1.2.3 差減法 差減法是基于花青素經(jīng)二氧化硫或亞硫酸鹽漂白后，其可見光的光譜特征消失，而干擾物質(zhì)的吸光度則幾乎不受影響的原理建立的方法。毛建霏等[22]采用改進(jìn)的差減法測定了紫甘薯的花青素含量。由于漂白劑能降低某些干擾組分的吸光度，因此該方法的實(shí)測含量高于理論含量；另外，由于漂白劑選擇性差，輔色劑、金屬離子等對花青素紫外可見光吸收有影響，以及游離花青素在弱酸條件下不穩(wěn)定等因素，導(dǎo)致該方法的應(yīng)用受到局限，目前已很少使用。

在測定花青素總含量時(shí)，若僅在同種材料之間比較，可選用操作簡便的單一pH法；若要求得到同種材料的準(zhǔn)確含量，多采用pH示差法。而測定花青素單組分成分或不同種材料的花青素含量，紫外-可見光譜法不適宜。

2 紙層析法與薄層層析法

紙層析法和薄層層析法始于20世紀(jì)40年代,是花青素類物質(zhì)分析早期所采用的經(jīng)典方法，該法根據(jù)花青素類物質(zhì)在不同溶劑中的遷移值(Rf)和顏色對其進(jìn)行定性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低、分析迅速、設(shè)備簡單，而且直觀性和可比性均較好，可在同一色譜板上根據(jù)組分性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測方法進(jìn)行定性或定量；即使無標(biāo)準(zhǔn)樣品對照，也可通過同一樣品在多種不同展開劑中的Rf值，對花青素類物質(zhì)進(jìn)行粗略定性。王本曉等[23]用薄層層析法分析發(fā)現(xiàn)，玫瑰花中主要的花青素為矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷。王娜等[24]用紙層析等方法對樟樹果的花青素組成進(jìn)行了初步鑒定。

紙層析和薄層層析是基于與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的對照，從而分離和識別混合物體系，當(dāng)樣品中的化合物較復(fù)雜時(shí)，該方法很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確的分析與鑒定，特別是對于同分異構(gòu)體，其分辨率低、重現(xiàn)性差的弊端更為明顯。隨著薄層色譜儀自動(dòng)化程度的提高，定量測試結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性也有所改善。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)以經(jīng)典的色譜法為基礎(chǔ),引入了氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)方法,流動(dòng)相改為高壓輸送, 采用高效固定相及在線檢測手段發(fā)展而成的一種高效快速分離分析技術(shù)。從20世紀(jì)70年代初，研究者開始利用HPLC對花青素類化合物進(jìn)行單組分成分的定性及定量研究。HPLC可以在30 min內(nèi)檢測出15種花色苷的單組分成分，分辨能力與速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過紙層析和薄層層析；基于花色苷的含量與色譜圖中的花色苷的峰面積成正比,HPLC還可用于定量分析。HPLC法分析時(shí)間短、分辨率高、熱降解少，現(xiàn)已成為應(yīng)用最廣泛的花青素類物質(zhì)分析方法之一[25]。K?hk?nen等[26]采用HPLC法對越橘、黑醋栗、牛莓總花青素含量分別進(jìn)行了測定。Séverine 等[27]利用HPLC檢測出歐越橘中含有15種花青素組分。岳喜慶等[28]將HPLC與分子質(zhì)量校正系數(shù)(MWCF)計(jì)算方法相結(jié)合，采用雙標(biāo)樣(C3G和P3G)分別對樣品中具有對應(yīng)母環(huán)的花青素進(jìn)行了定量計(jì)算，避免了樣品分子質(zhì)量和花青素母環(huán)與標(biāo)樣不同而產(chǎn)生的影響，從而獲得了更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。HPLC定量法是將混合狀態(tài)的成分分離以后,再行定量,因此適用于花青素單組分成分或不同種材料花青素含量的定量。

超高效液相色譜(UPLC)與HPLC技術(shù)具有相同的分離原理。UPLC基于HPLC原理并結(jié)合使用了新型耐壓小顆粒填料、全新篩板及色譜柱硬件，其色譜柱的性能較HPLC柱有質(zhì)的飛躍，與HPLC相比，分析的通量、靈敏度及色譜峰容量大幅度增加，并且可在保證較高分離度的同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速的分離。

HPLC和UPLC常常與各種光譜、質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)聯(lián)用，克服了缺少標(biāo)準(zhǔn)品、對復(fù)雜基質(zhì)有局限性等缺陷，提高了鑒定的能力與準(zhǔn)確性。

4 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜是20 世紀(jì)初發(fā)展起來的物理分析方法。質(zhì)譜是將高純樣品離子化，并依據(jù)質(zhì)荷比(m/z)不同的離子在電場或磁場中運(yùn)動(dòng)行為不同而對其進(jìn)行分離，并獲得樣品的離子質(zhì)量譜圖。質(zhì)譜分析可得到花色素苷的分子離子峰及其相應(yīng)的糖苷配基碎片峰和糖碎片峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜的對照或按各類分子的離子化規(guī)律解析質(zhì)譜，判斷試樣中花青素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、線形范圍寬和穩(wěn)定性好。因?yàn)橘|(zhì)譜分析法僅可分析高純樣品，所以其常與其他分離技術(shù)聯(lián)合使用。

最新發(fā)展起來的電噴霧離子化(ESI)質(zhì)譜分析法采用軟電離，能直接測定熱不穩(wěn)定的極性化合物，并可控制離子的斷裂，從而建立復(fù)雜提取物的“多酚指紋”[29]；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)適于精確測定高分子量的分子，已成功應(yīng)用于原花青素低聚物的研究，在反射模式下可分析到七聚物，在線性模式下可分析至九聚物[30]；氙氣快原子轟擊質(zhì)譜可獲得樣品離子化后的分子離子峰等相關(guān)數(shù)據(jù)，該方法適用于極性大分子量化合物；電子轟擊質(zhì)譜(LC-EI-MS)和激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-MS)適用于分析極性大、熱穩(wěn)定性差和難揮發(fā)的花青素類物質(zhì)；飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(TOF-MS/MS)可在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨，對復(fù)雜體系或混合物中化合物的鑒別非常有效。

5 核磁共振光譜法

核磁共振法是20世紀(jì)90年代迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，是鑒別花青素類化合物中未知結(jié)構(gòu)的有利工具。常用的1H-NMR和13C-NMR譜法可鑒定液態(tài)或溶液態(tài)的花青素類化合物結(jié)構(gòu)，確定和區(qū)分物質(zhì)的幾何構(gòu)象、光學(xué)異構(gòu)體，對花青素類物質(zhì)的同分異構(gòu)體及其糖苷和?；稽c(diǎn)的分析較質(zhì)譜分析法更具優(yōu)勢。NMR技術(shù)具有分析快速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，可用來研究化合物的三維結(jié)構(gòu)，是鑒別未知物的有利工具。Caridi等[31]使用氘化的二甲基亞砜(DMSO-d6)作為溶劑獲得了洋蔥的NMR光譜(1H和2D光譜)，通過其與氘化溶液中殘余的1H信號對比而分類和定量了所含的槲皮素糖苷。Zhang等[32]以氘化的二甲基亞砜(DMSO-d6)或甲醇(CD3OD)作為溶劑獲得了核桃仁1H和13C的NMR光譜，鑒定了其所含的抗氧化物質(zhì)。

由于核磁共振法所用設(shè)備昂貴、比高效液相色譜法檢測靈敏度低[6]、所需純樣品量大(mg級)、數(shù)據(jù)獲取時(shí)間較長，因此應(yīng)用受到很大限制。

6 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法

20世紀(jì)80年代Jorgenson[33]及Shigeru等[34]創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管區(qū)帶電泳法。毛細(xì)管區(qū)帶電泳是以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，該方法基于毛細(xì)管兩端加上一定的電壓后，荷電溶質(zhì)便朝著與其電荷極性相反的電極方向移動(dòng)的原理。由于樣品組分的淌度不同，其遷移速度也不同，各組分依次到達(dá)檢測器被檢出，最終獲得按時(shí)間分布的電泳譜圖。毛細(xì)管區(qū)帶電泳主要適用于定性和定量高度水溶性的花青素類物質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度強(qiáng)、分辨率高、樣品消耗少和溶劑需要量少等。Sáenz-López等[35]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析了酒齡在1～14年的紅葡萄酒中的花青素種類。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳雖然易分離聚合色素，具有比HPLC更短的保留時(shí)間、更少的溶劑消耗和更低的成本，但由于毛細(xì)管檢測池光程過短，且進(jìn)入毛細(xì)管的待測樣品體積過小，其靈敏度、分離能力和范圍及結(jié)果重現(xiàn)性都較HPLC差[5]。另外，花青素類物質(zhì)可能會由于毛細(xì)管區(qū)帶電泳的外加電壓或離子之間的相互作用而發(fā)生降解。

7 紅外、近紅外光譜法

早在20世紀(jì)50年代，國外的科學(xué)家就開始應(yīng)用紅外光譜研究花色苷，紅外光譜法是根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息來鑒定化合物并確定其分子結(jié)構(gòu)的分析方法，其優(yōu)點(diǎn)是特征性高、分析時(shí)間短、樣品需要量少等?；ㄉ盏募t外光譜有苯環(huán)、含氧雜環(huán)、甲氧基、糖和羥基4個(gè)主要部分。曾哲靈等[36]采用紅外光譜法對玫瑰茄紅色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，推斷玫瑰茄紅色素為矢車-葡萄糖苷類或飛燕草-葡萄糖苷類色素。紅外光譜法鑒定花青素類物質(zhì)通常采用比較法，即將樣品光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比分析，因此需要大量的標(biāo)準(zhǔn)圖譜作對照，這是該方法的主要限制因素。

近紅外光譜是近年來逐漸發(fā)展起來的快速檢測方法，該方法利用被測物的含量與近紅外區(qū)內(nèi)多個(gè)不同波長吸收峰面積的線性關(guān)系，可對待測樣品進(jìn)行快速、原位和無損的定性和定量檢測。王姍姍[37]建立了近紅外光譜數(shù)學(xué)模型，測定了不同品種藍(lán)莓的花青素含量；王曉琴等[38]建立了石榴中花色苷定標(biāo)模型，分析了我國5個(gè)主要石榴產(chǎn)區(qū)的石榴中花色苷的含量。國外最近報(bào)道，采用近紅外光譜法并結(jié)合多變量校正可較好地分析水果中的花青素[39]。近紅外光譜分析的不足之處是測定靈敏度較低，相對誤差較大，并且要求被測組分的含量應(yīng)大于0.1%，建模難度大。

8 多種分析技術(shù)的聯(lián)用

表2總結(jié)了目前常用花青素分析方法的功能和目的，并對其優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍等進(jìn)行了比較。由表2可見，僅采用一種方法很難準(zhǔn)確表征花青素的結(jié)構(gòu)，因此多種分析技術(shù)聯(lián)用得到迅速發(fā)展。

表2 花青素類化合物主要分析表征方法及優(yōu)缺點(diǎn)對比

續(xù)表 2 Continued table 2

8.1 雙技術(shù)聯(lián)用

在花青素類物質(zhì)分析的雙技術(shù)聯(lián)用中，常用的有高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、高效液相色譜-紫外可見光譜(HPLC-UVVis)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)、薄層層析-紫外可見光譜(TLC-UVVis)等，其中HPLC-MS結(jié)合了高效液相色譜的強(qiáng)分離能力與質(zhì)譜的強(qiáng)鑒定能力，具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢出限低的特點(diǎn)，克服了花色苷標(biāo)準(zhǔn)品缺少問題，適用于低含量花青素的定性和定量檢測，廣泛用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的花青素，如原矢車菊素、原花青素、原花翠素和單寧等結(jié)構(gòu)的鑒定與分析[40]。Yang等[41]利用HPLC-MS發(fā)現(xiàn)，紫玉米中主要存在6種花青素，分別為矢車菊色素-3-葡萄糖苷、天竺葵色素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷及與這3種花青素相應(yīng)的丙二酸鹽衍生物。不過，由于花青素僅在低pH條件下(pH≤3)比較穩(wěn)定，而低pH值將抑制電噴霧質(zhì)譜的離子化，這影響了質(zhì)譜分析的效果，導(dǎo)致該聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用受到限制。此外，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用具有高分離效能、強(qiáng)結(jié)構(gòu)分析能力和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)樣量小導(dǎo)致檢測靈敏度較低的缺點(diǎn)，已廣泛用于食品花青素的檢測[6]。

石秀花等[42]利用紙層析和紫外-可見光譜聯(lián)用鑒定出野玫瑰中的花青素，表明其花青素分別為芍藥色素-3-葡萄糖苷和飛燕草花色素-3-葡萄糖鼠李糖苷。毛建霏等[43]利用高效液相色譜-紫外光譜聯(lián)用確定了紫甘薯中花青素的總含量。

8.2 多技術(shù)聯(lián)用

聯(lián)合應(yīng)用高效液相色譜、紅外吸收光譜、質(zhì)譜、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、核磁共振波譜等多種方法和技術(shù)能夠顯著增強(qiáng)花青素類物質(zhì)的分析能力。Acevedo等[44]聯(lián)用高效液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振波譜等鑒定了4種野葡萄品種(Vitisvinifera,Vitisamurensis,Vitiscinerea和VitisXchampinii)中的33種花青素類物質(zhì)，并首先發(fā)現(xiàn)了p-香豆酸順式異構(gòu)體的衍生物(矮牽牛配基-，芍藥素-和錦葵色素-3-(6-p-香豆酰)5-二糖苷)。Lee等[45]聯(lián)用高效液相色譜-二極管陣列檢測-電噴霧質(zhì)譜和核磁共振(1HNMR和13CNMR)技術(shù)，檢測出刺五加果實(shí)中的花青素主要為矢車菊-3-O-(2″-O-木糖)-葡萄糖苷。李穎暢等[46]聯(lián)用紫外-可見光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、薄層色譜和核磁共振(1HNMR和13CNMR)技術(shù)，鑒定出自圣云藍(lán)莓果中提取出的單體化合物為錦葵色素-3-半乳糖苷?？琢瞵幍萚47]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS) 與毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(CE-ED)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，黑米色素主要含有矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷2種花色苷。

高效液相色譜-二極管陣列檢測-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-DAD-ESIMS)可直接對花青素類物質(zhì)的提取液進(jìn)行定性和定量，根據(jù)二級(或多級)質(zhì)譜既可鑒定花青素苷元的類型，也可推測其糖苷化、酰基化和甲氧基化等結(jié)構(gòu)。如Garzón等[48]利用HPLC-DAD-ESIMS測定了哥倫比亞野生越橘中的花青素和酚類組成；我國學(xué)者利用該技術(shù)已鑒定出黑樹莓[49]、紫洋蔥[50]、紫山藥[51]、野生桑葚[52]、多葉羽扇豆[53]等多種植物中花青素的結(jié)構(gòu)。

另外，串級分析也可提高分析能力。如HPLC-MS/MS、UPLC-MS/MS可對復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，若HPLC無法充分分離其組成成分，則可通過MS1及MS2對目標(biāo)化合物進(jìn)行中性碎片掃描，以顯著提高信噪比，從而對其進(jìn)行鑒定。Goupy等[54]和Wiczkowski等[55]采用UPLC-DAD-ESI-MS/MS確定了番紅花和紫甘藍(lán)花青素的主要成分；李偉等[56]采用UPLC-ESI-MS/MS技術(shù)從黑粒小麥麩皮中分離并鑒定了9種花青素類物質(zhì)。同為質(zhì)譜技術(shù)，飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(TOF-MS/MS)具有分辨率高、質(zhì)量范圍寬、掃描快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為重要的發(fā)展方向[57]。Barnes等[58]聯(lián)用HPLC-ESI-IT-TOF-MS/MS技術(shù)，從藍(lán)莓中鑒別出了25種花青素。常虹等[59]用HPLC-DAD-IT-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)推斷了歐李花青素的主要組成。

9 結(jié)論與展望

花青素類物質(zhì)鑒定技術(shù)已由紙層析、薄層層析等傳統(tǒng)技術(shù)向超高效液相色譜、質(zhì)譜、近紅外光譜、核磁共振等多手段聯(lián)用發(fā)展，使花青素類物質(zhì)的定量以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜或含量較低的花青素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定更加準(zhǔn)確、可靠和快速，為花青素資源的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。但由于這些先進(jìn)技術(shù)的試驗(yàn)成本較高，普通實(shí)驗(yàn)條件下的應(yīng)用受到限制，故應(yīng)在以下方面進(jìn)行深入研究。

(1)探尋低成本、高效率、簡便可行的花青素類物質(zhì)的提取、分離純化技術(shù)，以便對其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

(2)進(jìn)一步探索花青素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，尋找新的結(jié)構(gòu)特性及表征花青素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)方法。

(3)研究與花青素類物質(zhì)共存的有機(jī)物種類及其光譜特性，建立消除光譜干擾的新方法。

(4)總結(jié)不同花青素單體的生物活性，尋求新的高選擇性分析花青素的特性指標(biāo)。

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