劉鵬娟，黃 山，朱 玲＊，周遠(yuǎn)成，卓秀萍，覃娟娟，顧 凡

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川雅安625014；2.四川省雅安市石棉縣畜牧局，四川雅安625400）

豬呼腸病毒（Porcine reovirus）為正呼腸病毒屬成員，屬于分節(jié)段的雙鏈RNA（dsRNA）病毒［1］。該類病毒最早于20世紀(jì)50年代從人的呼吸道與胃腸道被分離出來，證實了dsRNA 病毒能夠以穩(wěn)定的生命形式存在于自然界。呼腸病毒的宿主譜極為廣泛，可從人和多種哺乳動物（如豬、牛、犬等）及禽體內(nèi)分離。此外，從河水、污水中也能檢出呼腸病毒。目前已報道的豬源呼腸病毒共3個血清型［2］，廣泛存在于豬群。Kasza等1970 年分別報道了血清1型，Robl等1971年報道了血清3型，F(xiàn)ukutomi T 等1996年在日本首次報道了血清2 型。豬感染呼腸病毒后多數(shù)不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但嚴(yán)重者可引起呼吸系統(tǒng)或胃腸道疾?。?-4］。用呼腸病毒1 型感染豬可再次從其糞樣中檢出病毒，同時仔豬體溫很快升高且具有傳染性，提示人們需謹(jǐn)慎對待呼腸病毒，并應(yīng)對其與發(fā)病豬的關(guān)系做進(jìn)一步研究。

1 形態(tài)特征

負(fù)染電鏡下，豬呼腸病毒為5∶3∶2立體對稱的二十面體球形顆粒，無囊膜，直徑約65nm～72 nm。呼腸病毒顆粒由內(nèi)衣殼與外衣殼組成，其中內(nèi)衣殼含10條dsRNA 基因組［5］。電鏡和三維重構(gòu)映像分析及X 射線晶體衍射表明，呼腸病毒外衣殼以不完全的T＝13對稱排列，內(nèi)衣殼以T＝1或T＝2對稱排列。

2 理化特性

豬呼腸病毒在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，對氯仿、乙醚和胰蛋白酶均具抵抗力，50℃加熱1h易失活，屬中度耐熱，紫外線可滅活病毒。完整病毒粒子在氯化銫密度梯度離心時的浮力密度為1.36g／mL。病毒核心能夠合成RNA 聚合酶，該酶于28℃時活性最強，且穩(wěn)定性可保持14h以上。病毒毒力差異與保存時間、溫度有關(guān)。豬呼腸病毒具有血凝性，在4℃、22℃、37℃時能夠凝集人O 型及豬紅細(xì)胞［6-7］。

3 培養(yǎng)特性

小鼠L929纖維原細(xì)胞系可培養(yǎng)豬呼腸病毒，可用于病毒的生長、純化和空斑試驗。目前多用Vero細(xì)胞（培養(yǎng)液中添加胰酶）對病毒進(jìn)行培養(yǎng)和分離鑒定［8］。呼腸病毒復(fù)制比較緩慢，多數(shù)新生病毒（約80%）在細(xì)胞內(nèi)存活，其引起的細(xì)胞病變?nèi)Q于所用的細(xì)胞系。通常感染細(xì)胞出現(xiàn)以穩(wěn)定的細(xì)胞顆粒增多、腫脹、變圓、漂落等為特征的細(xì)胞病變。姬姆薩染色可觀察到嗜酸性胞質(zhì)內(nèi)包涵體［9］。感染細(xì)胞中，特征性微管樣結(jié)構(gòu)明顯，病毒粒子多數(shù)以晶格狀排列，大小約70nm。

4 臨床癥狀與病理變化

4.1 流行病學(xué)與臨床癥狀

呼腸病毒在豬群中流行普遍，3 種血清型的抗體在豬體內(nèi)都可檢測到。該病毒經(jīng)口糞途徑或呼吸道感染［10］。新生仔豬體內(nèi)的母源抗體可維持11周左右，任何年齡豬對呼腸病毒都有易感性。從患呼吸道或胃腸道疾病的豬、流產(chǎn)胎兒、臨床健康的豬體內(nèi)都可分離出呼腸病毒。用1型呼腸病毒對1周齡～6周齡哺乳仔豬進(jìn)行鼻內(nèi)、腹腔或腦內(nèi)接種，多不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，或少數(shù)出現(xiàn)輕度發(fā)熱。接種24 h后，病毒可經(jīng)消化道與呼吸道排出體外，并持續(xù)6d～14d［11］。斷奶仔豬鼻內(nèi)接種1型呼腸病毒，通常表現(xiàn)輕微呼吸道癥狀，以發(fā)熱、打噴嚏、精神沉郁、食欲不振等為主要特征。用3型呼腸病毒對懷孕40d～85d的經(jīng)產(chǎn)母豬進(jìn)行肌肉或靜脈注射，可引發(fā)弱胎、死胎或木乃伊胎等，病毒可從母豬胎盤和流產(chǎn)排泄物中分離。

4.2 病理變化

豬感染呼腸病毒后很少出現(xiàn)明顯病理變化，一般只顯示輕微的顯微病變［12］。1周齡未哺乳仔豬經(jīng)口感染豬源呼腸病毒可引起空腸與回腸絨毛萎縮。用1型呼腸病毒感染4周齡SPF豬，不會引起明顯的全身性病變，但可導(dǎo)致肺部顯微病變-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在肺部及肺泡間隔多灶性積聚以及支氣管淋巴細(xì)胞肥大性增生。用3 型呼腸病毒對70kg SPF仔豬鼻內(nèi)接種，可導(dǎo)致肺泡型肺氣腫和支氣管淋巴細(xì)胞肥大性增生，但各肺小葉之間的病變程度不同。

5 分子生物學(xué)特性

5.1 基因組特征

電鏡及3′末端羥基定量分析表明，豬呼腸病毒全部的基因組由10條dsRNA 片段組成，包括L1，L2，L3，M1，M2，M3，S1，S2，S3和S4。由于病毒基因組的分節(jié)段性，導(dǎo)致不同病毒毒株具有高度變異性和復(fù)雜性。根據(jù)核酸電泳遷移率的不同，將豬呼腸病毒基因片段按分子質(zhì)量大小分為3組，即3個大基因節(jié)段（L1、L2 和L3），3 個中基因節(jié)段（M1、M2和M3）和4個較小基因節(jié)段（S1、S2、S3和S4）。呼腸病毒的每個基因片段都有5′端（GGUAUU）和3′端（UGAU）的保守序列［11-13］。

5.2 基因編碼蛋白及其功能

5.2.1 核衣殼組分λ1與σ2 豬呼腸病毒基因片段L3和S2分別編碼λ1（142ku，1 275aa）和σ2（47 ku，418aa）［14］。λ1和σ2為病毒核心衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，λ1為120 拷貝，σ2 有150拷貝。兩者都能與病毒的雙鏈RNA 結(jié)合，但σ2的結(jié)合能力弱于λ1蛋白，它們對病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制起著重要影響。λ1蛋白還具有解旋酶和NPT 酶特征序列，具備解旋酶與RNA 三磷酸酶兩種酶活性［15］。由此證明，λ1蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄中基因組負(fù)鏈的解旋及帽化過程參與了能量供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)［16］，僅將λ1 蛋白于鼠纖維原細(xì)胞中表達(dá)，不能形成20 面體顆粒。但若有σ2同步表達(dá)即可形成，表明σ2對呼腸病毒形成核衣殼構(gòu)象有重要意義。

5.2.2 外殼釘狀物突起λ2 呼腸病毒L2基因片段編碼λ2蛋白（144ku，1 288aa），λ2有60拷貝，是五聚體蛋白。研究表明，λ2具有甲基化酶和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（即加帽酶）活性，在病毒mRNA 合成與外殼裝配過程中起到重要作用。已證實，λ2與內(nèi)衣殼蛋白λ1、λ3及外衣殼蛋白σ1、σ3、μl有較強的親和作用與聯(lián)系［17-18］。

5.2.3 微量核心組分λ3 與μ2 呼腸病毒微量核心組分λ3（142ku，1 267aa）和μ2（83ku，736aa）由基因片段L1和M1節(jié)段編碼，在病毒中含量較低，分別有12拷貝和20拷貝。對于病毒結(jié)構(gòu)的組裝，這兩種蛋白無明顯框架作用，但具備非常重要的酶活功能。λ3 具有poly（C）依賴于poly（G）的RNA聚合酶活性，且在病毒復(fù)制中與λ1、λ2和μ1蛋白有相互作用。而μ2可作為一種調(diào)節(jié)蛋白，在病毒復(fù)制過程中協(xié)同λ1蛋白決定三磷酸核苷酶的活性［19］。

5.2.4 外衣殼結(jié)構(gòu)蛋白 病毒蛋白μ1（76ku，708 aa）、σ1（50ku，455aa）、σ3（41ku，365aa）分別由基因片段M2、S1、S4編碼，構(gòu)成病毒外衣殼組分。μ1和σ3蛋白形成多聚體，是外衣殼蛋白的主要組分，二者均為600拷貝。μ1蛋白主要以μ1N（4ku）片段和μ1C（72ku）片段形式存在于病毒中，其功能是在病毒入侵宿主時參與穿過細(xì)胞膜屏障。μ1 裂解產(chǎn)生μ1C和μ1N，μ1C 可進(jìn)一步裂解為δ和ψ。研究發(fā)現(xiàn)，μ1多肽鏈可形成4種不同結(jié)構(gòu)域而造成蛋白構(gòu)象的改變，其機制是為了保證病毒的膜穿透功能。σ3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可與單鏈RNA 結(jié)合并控制翻譯［18，20］。作為雙順反子的基因片段S1可編碼σ1和σ1s，這兩種蛋白決定病毒的感染性、致病力和毒力。σ1蛋白以三聚體形式出現(xiàn)，是一種細(xì)胞吸附蛋白，可在病毒入侵細(xì)胞時介導(dǎo)病毒與受體的結(jié)合，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；σ1s蛋白可阻斷細(xì)胞的生長周期。

6 致病機制

呼腸病毒可經(jīng)兩種途經(jīng)入侵細(xì)胞，一是病毒粒子吸附于細(xì)胞表面的特異性受體，通過由受體介導(dǎo)的胞吞作用入侵細(xì)胞，并借助溶酶體中的蛋白酶降解自身外衣殼，形成具感染性的次病毒顆粒；二是部分病毒粒子在細(xì)胞外經(jīng)蛋白酶降解生成ISVP 后直接入侵細(xì)胞，而不必依賴于由受體介導(dǎo)的胞吞作用［21］。

細(xì)胞凋亡是呼腸病毒對宿主造成組織損傷的主要機制［22-23］。呼腸病毒可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的體外凋亡，研究病毒感染的動物模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡對心臟和大腦組織的損傷起重要作用。由于不同毒株的致病性不同，引起細(xì)胞凋亡的能力也不相同。呼腸病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效率取決于病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合的能力。此外，呼腸病毒可使細(xì)胞生長周期的G1、G2或M 期停止，不同毒株誘導(dǎo)生長周期停止的能力取決于可編碼σ1和σ1s蛋白的S1 基因節(jié)段，σ1蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞生長停止于G1 期，而σ1s蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞生長停止于G2或M 期。

7 病毒檢測

由于呼腸病毒導(dǎo)致豬的臨床癥狀和病理變化都不具特征性，該病的診斷一般需要分離病毒。檢測豬源呼腸病毒方法有很多，其中以電子顯微鏡技術(shù)最為直觀有效。由于呼腸病毒形態(tài)特殊，電鏡觀察的特異性較強，所以是檢測少量樣品時最迅速的方法。

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、補體結(jié)合試驗、空斑試驗、聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法雖然較復(fù)雜，但仍是診斷豬源呼腸病毒的主要手段［24-26］。此外，現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)展大大提高了檢測效率。RTPCR 是近年來發(fā)展最迅速的檢測技術(shù)，該方法可檢測痕量樣品，敏感性和特異性都很高，最小檢測量可達(dá)0.1pg病毒核酸，是豬呼腸病毒檢測技術(shù)發(fā)展的主要方向。血清學(xué)診斷也是檢測豬源呼腸病毒的一種方法［27］。由于豬呼腸病毒可凝集人O 型及豬紅細(xì)胞，可利用3種呼腸病毒的抗血清，通過病毒中和試驗和血凝抑制試驗來鑒別不同的血清型。

8 防控措施

呼腸病毒感染豬所致的呼吸系統(tǒng)和消化道疾病，目前尚無特異性的預(yù)防與治療方法。由于國內(nèi)外對防控該病毒感染的研究較少，可從分子水平對病毒與感染宿主的相互作用關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)一步探究病毒的致病與免疫機制。具體可從分析不同分離株病毒基因所編碼的蛋白與毒株毒力的相互關(guān)系、病毒與宿主的相互作用機制入手，為研究安全、高效、可靠的防控措施奠定基礎(chǔ)［28］。

9 展望

針對呼腸病毒感染豬導(dǎo)致的疾病，目前尚無特異性的防控方法。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，筆者對防控豬呼腸病毒感染提出新的思考：①由于編碼σ1和σ1s蛋白的S1基因節(jié)段決定著病毒毒力，可通過選擇性地抑制呼腸病毒S1基因的表達(dá)來降低病毒的致病性。例如，Shahi S 等［29］證實了核酶可有效抑制呼腸病毒的S1基因，利用核酶處理后的細(xì)胞來抑制病毒感染有望成為防控該病的新策略。②當(dāng)今已有干擾載體面世，可嘗試?yán)肦NA干擾技術(shù)來抑制病毒的復(fù)制。豬呼腸病毒表達(dá)重要酶的序列具有高度保守性，可作為RNAi的靶基因，在復(fù)制早期發(fā)生抑制，以達(dá)到防控目的。③通過直接抑制細(xì)胞凋亡來降低病毒對感染組織的損傷，也可能為治療提供新的思路。

豬呼腸病毒的基因組為dsRNA，RNA 病毒的快速進(jìn)化和高適應(yīng)能力很大程度上取決于它的高突變率。基因內(nèi)突變可以是點突變、插入或缺失等。分節(jié)段RNA 病毒除基因突變外，還可發(fā)生基因重排，如流感病毒16種H 亞型和9種N 亞型可發(fā)生上百種排列組合。豬呼腸病毒基因組含10個dsRNA 節(jié)段，其突變方式既可是基因內(nèi)突變，也可能是基因片段重排。何小明等［30］于仔豬腹瀉糞樣中分離出SHR-A 株病毒，研究發(fā)現(xiàn)其S1-S4基因片段存在基因突變和重排，還發(fā)現(xiàn)其S1基因是血清1型和3型的嵌合體，證明SHR-A 發(fā)生了基因重組。對豬源呼腸病毒的遺傳變異和進(jìn)化有待進(jìn)一步深入研究。

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