孟慶宇 施維群 倪 偉 陸增生 何 創(chuàng) 黃靈躍

1.浙江中醫(yī)藥大學(浙江 杭州，310038) 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院

HBV 持續(xù)感染的主要免疫學特征是病毒特異性CD4+T 細胞和CD8+T 細胞不同程度的低應答狀態(tài)，多項研究［1，2］證實，PD-1/PD-L1 高表達可能導致特異性T 細胞功能衰竭，增殖活性降低，細胞因子尤其是IFNγ，TNFα，IL-2 等產(chǎn)生不足，導致非細胞毒性病毒清除能力下降。因此通過阻斷或下調(diào)PD-1/PDL1 表達，使功能衰竭的特異性CD8+T 細胞功能恢復，從而促進HBV 清除，不失為治療CHB 的一個重要途徑。

我們在核苷(酸)類似物抗病毒的基礎上，增添中藥芪靈合劑的干預，對CHB 治療的臨床療效可以在HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率、ALT 復常率等體現(xiàn)優(yōu)勢。既往的研究也證實，芪靈合劑中黃芪、仙靈脾具有一定的抗病毒和調(diào)節(jié)免疫的作用。現(xiàn)通過芪靈合劑干預的CHB 患者外周血CD4+T 細胞表面PD-1/PD-L1 表達的研究，認識到CHB 免疫治療與抗病毒一樣不可或缺。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 56 例CHB 患者來自2012年8 月-2013年12 月浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院的住院及門診患者，年齡18～60 歲，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010 版)的標準:既往有乙型肝炎病史或HBsAg 陽性超過6 個月，現(xiàn)HBsAg 和(或)HBV DNA仍為陽性者，HBV DNA 陽性(HBV DNA≥104拷貝/m1)，ALT ＞2 ×ULN。自愿參加本試驗并接受隨訪和各項必要的檢查?；颊卟捎米栽阜玫脑瓌t，分設芪靈合劑聯(lián)合LAM 治療組(以下稱治療組)和單用LAM 對照組(以下稱對照組)。排除標準:甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者，失代償性慢性肝病，有自身免疫性疾病史，妊娠及哺乳期患者，有嚴重器質(zhì)性疾病、精神病、嗜酒、吸毒、肝毒性藥物使用史，近期使用核苷(酸)類藥物和干擾素等抗病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)劑。兩組患者基線情況比較，見表1。

表1 兩組患者基線比較(±s)

表1 兩組患者基線比較(±s)

1.2 治療方法 治療組患者給予芪靈合劑(其中黃芪和仙靈脾的配伍比例為2∶1，濃縮為中藥合劑，以100ml 分裝，相當于生藥分別為30g 與15g，1 劑/d，分2 次口服)，口服LAM (100mg/d);對照組僅口服LAM (100mg/d)。LAM 片為葛蘭素史克中國公司生產(chǎn)，芪靈合劑為院內(nèi)自制制劑。

1.3 檢測指標 檢測患者治療前基線，治療24 周和48 周時血清ALT 水平、HBV DNA 水平、HBV-M、CD4+T 淋巴細胞及其表面PD-1/PD-L1 的表達。

1.4 主要試劑和儀器 肝功能用日本Olympus AU 2700 全自動生物化學分析儀檢測;乙肝三系檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，試劑購自上?？迫A生物工程股份有限公司。HBV DNA 定量檢測采用美國PE5700 實時熒光定量PCR 法檢測，最低檢測下限為103copies/ml。流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司，型號為EPICS XI 4-MCL，CD4-FITC、溶血劑等購自美國Becton Dicknson 公司，PE 標志的PD-L1、PD-1 及同型對照管購自美國eBioscience 公司;RT-PCR 試劑盒購自Fermentas 公司。

1.5 外周血PD-1/PD-L1 表達水平檢測 取3 支專用流式管，分別加入抗人CD4-FITC 抗體10μl 和MouseIgG1-PE 同型質(zhì)控2.5μl、抗人CD4-FITC 抗體10μl和抗PD-1-PE 抗體2.5μl、抗人CD4-FITC 抗體10μl和抗人B7-H1-PE 抗體2.5μl，然后每管各加入全血50μl，混勻，避光15min 后加入1ml 溶血劑，室溫放置10min，1 500r 離心，5min 棄上清，再分別加入lml 生理鹽水，混勻，1 500r 離心，5min 棄上清，最后加入500μl～1ml 生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀檢測。采用FS-SS 參數(shù)分析基礎上，對全PBMC 設門，設定CD4 陽性細胞門，檢測CD4+T 細胞上PD-1/PD-L1 的表達水平，并扣除同型對照的非特異性本底值。

1.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較用兩獨立樣本的t 檢驗;計數(shù)資料用(%)表示，組間采用卡方檢驗;P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者ALT 復常率和HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率比較見表2。

2.2 兩組患者CD4+T 細胞PD-1 表達水平比較 見表3。

表2 兩組患者ALT 復常率和HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率比較［% (n)］

表3 兩組患者CD4 +T 細胞PD-1 表達水平比較(±s)

表3 兩組患者CD4 +T 細胞PD-1 表達水平比較(±s)

與本組24 周比較，* P ＜0.05;與本組治療前比較，#P ＜0.01

2.3 兩組患者CD4+T 細胞PD-L1 表達水平比較 見表4。

表4 兩組患者CD4 +T 細胞PD-L1 表達水平比較(±s)

表4 兩組患者CD4 +T 細胞PD-L1 表達水平比較(±s)

與本組24 周比較，* P ＜0.05;與本組治療前比較，#P ＜0.01

3 討論

CD4+T 細胞(Th)主要分為Th1 和Th2 兩種亞型，其中Th1 分泌IFNγ、IL-2 等參與細胞介導的免疫應答，可以充分強化特異性CTL 反應，傾向于發(fā)生急性自限性感染和病原體清除。既往研究發(fā)現(xiàn)HBV 持續(xù)感染與Th1/Th2 失衡有關(guān)［3］，在CHB 患者體內(nèi)Th2 類細胞因子IL-6、IL-10 占優(yōu)勢，而Th1 類細胞因子IFN-γ、IL-2 明顯減少，HBV 清除不足，導致HBV 感染慢性化。彭國平等［4］研究表明CHB 患者PD-1 和PD-L1 表達水平是顯著增加的，另有學者證實Th1 細胞能誘導PD-L1 表達增強，而PD-1/PD-L1能抑制Th1 細胞的增殖，減少IFN-γ 和IL-2 等Th1類細胞因子的分泌，影響Th1/Th2 細胞的分化［5，6］。本項研究通過芪靈合劑聯(lián)合LAM 治療發(fā)現(xiàn)，CHB 患者外周血CD4+T 細胞表面PD-1/PD-L1 表達水平24周后有所下調(diào)，但與治療前相比無明顯差異，隨著治療時間延長其表達水平明顯下調(diào)，48 周的統(tǒng)計分析結(jié)果較24 周及治療前相比具有統(tǒng)計學意義，同時發(fā)現(xiàn)，治療組較對照組更有效地下調(diào)CHB 患者外周血CD4+T 細胞表面PD-1/PD-L1 表達水平(P ＜0.05)，雖然有報道，CHB 抗病毒治療早期能夠下調(diào)PD-1/PD-L1 表達水平［7］，但在本實驗中的對照組并未表現(xiàn)出明顯下調(diào)外周血CD4+T 細胞表面PD-1/PD-L1 表達水平的能力(P ＞0.05)。

CHB 患者血清基線高載量HBV DNA 是發(fā)生肝癌的獨立危險因素［8，9］，抗病毒治療可以延緩HBV 感染后肝硬化的進展及降低肝癌的發(fā)生率［10，11］，故清除或抑制病毒復制是預防肝臟嚴重不良預后發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。我們的研究注意到，對照組患者治療48 周后雖有較高的HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率(66.67%)，但其外周血CD4+T 細胞PD-1/PD-L1 表達水平并未有明顯下調(diào)(P ＞0.05)。而治療組患者的外周血CD4+T 細胞PD-1/PD-L1 表達水平除有明顯下調(diào)外，HBV DNA轉(zhuǎn)陰率也更高(89.66%)，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，另外ALT 復常率治療組也占明顯優(yōu)勢(72.47%VS 66.67%)。核苷(酸)類抗HBV藥物治療后，HBV 特異性CD8+T 淋巴細胞功能雖能逐漸恢復，但即使出現(xiàn)HBsAg/抗-HBs 轉(zhuǎn)換的患者其T 淋巴細胞功能恢復仍顯緩慢，有的甚至不能完全恢復。盡管對CHB 發(fā)病機制的研究已經(jīng)有了長足進展，但其發(fā)病機制尤其是免疫機制及相關(guān)免疫治療的進展難以有較大突破，病毒動力學及免疫學相結(jié)合的研究迫在眉睫。中醫(yī)認為CHB 發(fā)病是因人體正氣虛衰，不足以抗御外邪，導致疫毒侵襲，正所謂“邪之所湊，其氣必虛”。有研究者認為治療CHB 扶正之法在于調(diào)補脾腎，以平衡腎之元陰、元陽為要。此時臨證可以黃芪、仙靈脾為調(diào)補脾腎之基礎用藥。仙靈脾溫腎陽，黃芪補后天以滋先天［12］。多年臨床應用芪靈合劑后發(fā)現(xiàn)其能促進慢性HBV 感染患者病毒應答，提高HBV DNA 清除率，所復習的文獻提示，黃芪可明顯提高CHB 患者Th1 類細胞因子(IFNγ、IL-2)的產(chǎn)生，改善CHB 患者Th1/Th2 功能失衡狀態(tài)，可使CHB 患者Th2 細胞優(yōu)勢應答狀態(tài)部分得到糾正，并具有一定的抗病毒作用［13，14］。仙靈脾又稱淫羊藿［15］，研究發(fā)現(xiàn)［16，17］其有效成分淫羊藿多糖(EPS)具有促進小鼠T 細胞和B 細胞增殖的作用;EPS 通過促進胸腺成熟細胞向外周釋放而對胸腺產(chǎn)生免疫激活作用，能使小鼠胸腺和脾臟細胞合成IL-2 增多。結(jié)合研究結(jié)果，芪靈合劑能夠降低外周血CD4+T 細胞表面PD-1/PD-L1 表達水平，使Th1 細胞功能恢復，并促進其分化、增殖，IFNγ、IL-2 分泌增多，糾正CHB 患者Th1/Th2 功能失衡狀態(tài)。

在急性乙型肝炎早期，HBV 抗原特異性T 細胞PD-1 表達上調(diào)，并隨著病情的恢復而下調(diào)，但若PD-1/PD-L1 延遲表達或低水平表達，則易發(fā)展為急性肝衰竭，預后不良［18］。這提示，CHB 患者外周血PD-1/PD-L1 的表達早期如果大幅度降低具有一定的風險。芪靈合劑對CHB 患者的免疫調(diào)節(jié)具有持續(xù)、和緩甚至后續(xù)累積的效應，規(guī)避了PD-1/PD-L1 過早、過度下調(diào)所帶來的免疫損傷風險。本研究如能進一步延長干預時間，加強跟蹤隨訪，觀察PD-1/PDL1 表達水平是否有進一步下調(diào)的空間和維持較長時間的臨床效果，同時分析芪靈合劑對HBV 特異性CD8+T 細胞及IFNγ、IL-2 分泌水平的影響以及機理，則此項研究將更有意義。

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