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(黃河科技學(xué)院,河南鄭州 450063)

黑莓(Rubusspp. Blackberry)屬于薔薇科(Rasaceae)懸鉤子屬聚合果類植物,其果實(shí)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,具有改善人體新陳代謝、清除自由基、延緩衰老和增強(qiáng)免疫力等功能,特別具有降低膽固醇含量、防治心臟疾病、抗癌(降低化療引起的毒副作用)和抗血栓的功效[1 - 6]。

研究表明,黑莓籽油含有較高的不飽和脂肪酸,如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等[7],能夠提供給人體基本的脂肪酸,而且這些脂肪酸不能通過(guò)任何已知的化學(xué)途徑合成,必須從食物中獲取。另外,黑莓籽油具有清除自由基,抑制H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞氧化溶血,抑制VC- FeSO4體系誘導(dǎo)的小鼠肝組織丙二醛生成和小鼠肝線粒體腫脹等作用;黑莓籽油中富含各種抗氧化劑,與其抗心血管脂氧化和抗癌活性息息相關(guān)[8 - 9];此外,還發(fā)現(xiàn)黑莓籽經(jīng)脫脂后的主要有效成分為原花青素,是由單體黃烷 - 3 - 醇以不同聚合度連接而成的多酚類化合物,具有高效的清除自由基的能力,具有治療動(dòng)脈硬化、消炎防腫、抗突變和預(yù)防癌癥等廣泛用途[10 - 11]。

黑莓果汁、果酒等加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物黑莓籽。研究表明,黑莓籽殘留有豐富的脂肪酸、多酚等化合物。近年來(lái),河南省封丘縣調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),大面積推廣種植該品種,通過(guò)對(duì)黑莓籽研究,既可對(duì)其進(jìn)行有效的綜合利用,提高黑莓加工的綜合利用,又可變廢為寶,增加社會(huì)效益。本文采用尾靜脈注射四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型,首次研究黑莓籽對(duì)糖尿病小鼠血糖、脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

黑莓籽于2013年7月購(gòu)買于河南省封丘縣,由河南大學(xué)生藥教研室李昌勤教授鑒定為薔薇科(Rasaceae)懸鉤子屬聚合果類植物植物黑莓(Rubusspp. Blackberry)籽,標(biāo)本存于黃河科技學(xué)院天然藥物研究所。

健康昆明種小鼠120只,6 ～ 8周齡,體重(25±2)g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件:室溫控制在 25 ～ 27℃,自由采食和飲水,普通優(yōu)質(zhì)飼料喂養(yǎng)。

葡萄糖測(cè)定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TCH)測(cè)定試劑盒 浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司;肝/肌糖元測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、SOD試劑盒(測(cè)總) 南京建成生物工程研究所);阿卡波糖 杭州中美華成制藥有限公司;四氧嘧啶 Alfa Aesar。

UV - 2000型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司;LRH - 150恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;電子天平 美國(guó)Mettler - Toledo公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 黑莓籽浸膏的提取 黑莓籽粉采用浸出法,50L石油醚冷浸4次脫脂,每次3d,濃縮、回收石油醚得到黑莓籽油;殘?jiān)鼡]干石油醚后,加入40L 70%乙醇冷浸3次,每次3d,濃縮、回收乙醇得到黑莓籽乙醇總浸膏?？偨喾稚⒂谒?依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取,得黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

1. 2. 2 四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型[12 - 13]健康昆明小鼠150只,隨機(jī)分為兩組,正常對(duì)照組10只,其余的為糖尿病造模組。糖尿病造模組于禁食不禁水12h后,尾靜脈注射80mg/kg四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠。正常喂養(yǎng)72h后,禁食不禁水12h,眼眶取血,測(cè)空腹血糖水平,依據(jù)血糖均衡原則將血糖水平在11. 1mmol/L以上的小鼠分成14組:糖尿病模型組,阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照組,石油醚部位高、中、低劑量組,乙酸乙酯部位高、中、低劑量組,正丁醇部位高、中、低劑量組,油高、中、低劑量組。模型組和空白組灌胃0. 5%羥甲基纖維素鈉水溶液(CMC - Na),其它實(shí)驗(yàn)組用0. 5%CMC - Na分別配制成相應(yīng)濃度的溶液,灌胃給藥,1次/d,連續(xù)給藥7d,于末次給藥后2h眼眶取血測(cè)餐后血糖水平,并于當(dāng)晚禁食不禁水12h,第8d摘取眼球取血,分離血清,放置于冰箱(0 ～ 3℃)保存,用于測(cè)定給藥后空腹血糖、TG、TCH、MDA和SOD。處死動(dòng)物,取肝臟并稱重,并制備肝糖元測(cè)定液,用于測(cè)定肝糖元含量。

1. 2. 3 生理指標(biāo)測(cè)定方法 血糖按上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書操作;TG和TCH按浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書操作;肝糖元、MDA和SOD均按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

由表1可以看出,給藥前,與空白組相比,糖尿病組(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、油、陽(yáng)性對(duì)照和模型組)空腹血糖均呈顯著性升高(p<0. 05),說(shuō)明四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模成功,并且各給藥組之間無(wú)顯著性差異(p>0. 05)。

給藥治療7d后,與空白組相比,模型組餐后血糖呈顯著性升高(p<0. 001);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照能顯著性的降低餐后血糖(p<0. 01),除石油醚部位高劑量組、黑莓籽油中低劑量組降低餐后血糖無(wú)顯著性差異(p>0. 05),其他給藥均能顯著性的升高餐后血糖。從劑量 - 效應(yīng)關(guān)系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位餐后血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量正效應(yīng)依賴性;正丁醇部位餐后血糖逐漸降低,具有一定的劑量負(fù)效應(yīng)依賴性。

與模型組相比,除黑莓籽油中劑量組能顯著性的升高空腹血糖(p<0. 01),其他各劑量組空腹血糖均無(wú)顯著性差異(p>0. 05),其中石油醚部位中低劑量組、乙酸乙酯部位高中低劑量組、正丁醇部位高低劑量組以及黑莓籽油低劑量組空腹血糖值均低于模型組。從劑量 - 效應(yīng)關(guān)系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位空腹血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量正效應(yīng)依賴性;相反,乙酸乙酯部位空腹血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量負(fù)效應(yīng)依賴性。

從給藥后餐后血糖和空腹血糖綜合分析,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和油降血糖效果不佳。但是糖尿病引起血糖升高,可以加快葡萄糖的有氧氧化、增強(qiáng)蛋白的非酶糖基化作用和導(dǎo)致脂代謝異常,使體內(nèi)存在一定程度的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝紊亂。氧化應(yīng)激會(huì)使外周組織對(duì)胰島素的敏感性下降,葡萄糖的利用降低。

表1 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響Table 1 Effect of the different extracts of blackberry seed on blood

注:阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照;與空白組比較:ΔΔΔp<0. 001,ΔΔp<0. 01,Δp<0. 05;與模型組比較:* * *p<0. 001,* *p<0. 01,*p<0. 05;與陽(yáng)性對(duì)照組比較:###p<0. 001,##p<0. 01,#p<0. 05;表2 ～ 表4同。此外,氧化應(yīng)激還會(huì)加劇胰島β細(xì)胞凋亡,胰島細(xì)胞數(shù)目減少,降低胰島素的合成與分泌,使糖代謝異常進(jìn)一步加劇,因此,氧化應(yīng)激在糖尿病的病理衍變中起重要作用?？梢?高血糖會(huì)引起糖尿病患者抗氧化系統(tǒng)紊亂,產(chǎn)生氧化應(yīng)激,反過(guò)來(lái)氧化應(yīng)激又會(huì)影響糖代謝,由此形成惡性循環(huán)。需要進(jìn)一步研究糖尿病引起的脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激。

2. 2 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠肝糖元的影響

由表2可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠肝糖元含量顯著性的降低(p<0. 01);與模型組相比,石油醚部位中低劑量組、乙酸乙酯部位高中劑量組、黑莓籽油低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照均能顯著性的升高肝糖元的含量(p<0. 05),其他各劑量高肝糖元的含量無(wú)顯著性差異(p>0. 05),但是肝糖元含量均高于模型組?？梢?石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和油可能具有促進(jìn)肝糖元的合成,降低肝糖元的分解的作用。從劑量 - 效應(yīng)關(guān)系看,隨著給藥劑量的升高,黑莓油給藥組肝糖元含量逐漸降低,具有一定的劑量負(fù)效應(yīng)依賴性。

表2 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠肝糖元的影響Table 2 Effect of the different extracts of blackberry seed

2. 3 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠血脂水平的影響

由表3可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠血清中TCH含量顯著性的升高(p<0. 05);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照均能顯著性的降低TG(p<0. 05)和TCH的含量(p<0. 001),石油醚部位低劑量組、乙酸乙酯部位高中劑量和黑莓籽油高劑量組均能顯著性的降低TG和TCH的含量(p<0. 05),正丁醇部位低劑量組能顯著性的降低TG的含量,乙酸乙酯部位低劑量組、正丁醇部位高劑量組、黑莓籽油中低劑量組均能顯著性的降低TCH的含量(p<0. 05)?？梢?石油醚部位、乙酸乙部位、正丁醇部位和油能通過(guò)降低血清中TCH和TG的含量,來(lái)改善糖尿病并發(fā)癥—高血脂,糾正糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。從劑量 - 效應(yīng)關(guān)系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位TG含量和TCH含量以及正丁醇部位TG含量均逐漸升高,具有一定的劑量負(fù)效應(yīng)依賴性;正丁醇部位TCH含量逐漸降低,具有一定的劑量正效應(yīng)依賴性。

2. 4 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

由表4可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠血清中MDA含量顯著性升高(p<0. 01),SOD水平顯著性降低(p<0. 05),可見,糖尿病會(huì)引起機(jī)體抗氧化系統(tǒng)紊亂。與模型組相比,乙酸乙酯部位和黑莓籽油中劑量組均能顯著升高SOD水平(p<0. 05),石油醚部位和油的三個(gè)劑量組、乙酸乙酯部位高低劑量組以及正丁醇部位組升高SOD水平不具有顯著性(p>0. 05),但均高于模型組,石油醚部位低劑量組和正丁醇部位劑量組能顯著性的降低MDA含量(p<0. 05),石油醚部位高劑量組、乙酸乙部位高中劑量組、正丁醇部位中低劑量組以及油高劑量組降低MDA含量不具有顯著性(p>0. 05),但均低于模型組?？梢?石油醚部位低劑量組、乙酸乙酯部位中劑量組和正丁醇部位中劑量組能通過(guò)不同程度的降低血清中MDA的含量,升高SOD水平,增強(qiáng)糖尿病小鼠機(jī)體的抗氧化功能,保護(hù)機(jī)體免受自由基的進(jìn)一步傷害。從劑量 - 效應(yīng)關(guān)系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油降低MDA含量,升高SOD水平均不具有一定的劑量 - 效應(yīng)依賴性。

表3 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠血清中TG和TCH的影響Table 3 Effect of the different extracts of blackberry seed on the levels of TG and TCH in

目前,糖尿病是一組以長(zhǎng)期高血糖為主要特征的代謝綜合征,是由于胰島素缺乏和(或)胰島素生物作用障礙導(dǎo)致的糖代謝紊亂,同時(shí)伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等代謝障礙,并可并發(fā)眼、腎、神經(jīng)和心血管等多臟器慢性損害[12],并且在正常機(jī)體內(nèi)存在自由基產(chǎn)生和清除兩個(gè)系統(tǒng),共同維持機(jī)體的氧化還原穩(wěn)態(tài),如果活性氧簇產(chǎn)生過(guò)多和/或抗氧化酶如SOD活性下降,就可導(dǎo)致機(jī)體受氧化應(yīng)激損傷[15]。糖尿病發(fā)生后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基產(chǎn)生大量增加,機(jī)體抗氧化防御能力也下降。

文獻(xiàn)[16]報(bào)道,來(lái)自天然產(chǎn)物中萜類、胰島素、肽和氨基酸類、黃酮類、多糖類、硫醚類、生物堿類、香豆精類和不飽和脂肪酸類等類型的化合物具有一定的降糖作用,如胡蘆巴中芹菜素黃酮苷類化合物有降血糖活性[17]、當(dāng)歸多糖有降血糖作用[18]等。眾多植物中都存在清除氧自由基的抗氧化性功能因子,包含黃酮類、多酚類、原花青素類、生物堿類、維生素、植物激素和吲哚衍生物等[19 - 20]。這些類型的化學(xué)成分可能是黑莓籽較弱降糖、糾正脂質(zhì)代謝紊亂和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的有效成分,但是具體是哪些化合物具有降血糖作用,需要進(jìn)一步分離純化,進(jìn)行研究。

表4 黑莓籽不同提取部位對(duì)糖尿病小鼠血清SOD和MDA的影響Table 4 Effect of the different extracts of blackberry seed on the content of MDA and the level

3 結(jié)論

有文獻(xiàn)報(bào)道,黑莓籽油具有清除DPPH自由基和羥基自由基的能力,抑制VC- FeSO4體系誘導(dǎo)的小鼠肝組織丙二醛生成。本研究從糖尿病引起的脂質(zhì)過(guò)氧化角度進(jìn)行研究,結(jié)果表明,黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和油具有改善糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂,增強(qiáng)糖尿病小鼠機(jī)體的抗氧化防御功能,保護(hù)機(jī)體免受自由基的進(jìn)一步攻擊的作用。

[1]Turemis N,Kafkas E,Kafkas S,etal. Determination of Aroma Compounds In Blackberry by GC/MS Analysis[J]. Chemistry of Natural Compounds,2003,39(2):174 - 176.

[2]吳文龍,顧姻. 新經(jīng)濟(jì)植物黑莓的引種[J]. 植物資源與環(huán)境,1994,3(3):45 - 48.

[3]尹震花,王佳佳,顧海鵬,等. 黑莓(薩尼)果實(shí)體外抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(4):530 - 532.

[4]宋建強(qiáng),王華,胡勁光,等. 黑莓起泡酒香氣成分的GC/MS分析研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(8):145 - 149.

[5]李立,劉曄瑋,李紅兵,等. 黑莓果渣不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(3):116 - 118,122.

[6]Elisia I,Hu C,Popovich DG. Antioxidant assessment of an anthocyanin - enriched blackberry extract[J]. Food Chemistry,2007,101(3):1052 - 1058.

[7]朱紅葉,馬永昆,魏本喜. 超聲輔助提取黑莓籽油及其脂肪酸成分分析[J]. 中國(guó)油脂,2010,35(6):5 - 8.

[8]朱紅葉,馬永昆,白潔,等. 超聲波提取黑莓籽油的體外抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(5):53 - 56.

[9]張東升,陳亮,辛秀蘭,等. 黑莓籽油脂肪酸成分及抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(11):55 - 58.

[10]朱鳳妹,杜彬,李軍,等. 大孔吸附樹脂分離葡萄酒下腳料中原花青素的研究[J]. 食品工業(yè),2008(1):6 - 9.

[11]陳磊,王軍. 山葡萄籽中原花青素的提取[J]. 中國(guó)野生植物資源,2008,27(1):58 - 60.

[12]Kang WY,Song YL,Zhang L. a - Glucosidase inhibitory and antioxidant properties and antidiabetic activity of Hypericum ascyron L. [J]. Medicinal Chemistry Research,2011,20(7):809 - 816.

[13]Wei JF,Li YY,Shang FD. Antioxidant activities, a -glucosidase inhibitoryinvitroand effects of Lysimachia paridiformis Franch. var. stenophylla Franch. on alloxan - induced diabetic mice in vivo[J]. Journal of Medicinal Plants Research,2012,6(14):2793 - 2800.

[14]付文亮,付秀美,和亞強(qiáng),等. 生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子 - 1軸與糖尿病研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2010,30(19):2869 - 2872.

[15]楊升華,尹衛(wèi)東. 氧化應(yīng)激與糖尿病研究進(jìn)展[J]. 微量元素與健康研究,2011,28(3):54 - 57.

[16]茅彩萍,顧振綸. 具有降血糖作用植物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)野生植物資源,2001,20(5):1 - 4.

[17]單俊杰,任晉瑋,武春密,等. 胡蘆巴黃酮苷及其降血糖活性的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志,2008,43(19):1457 - 1460.

[18]許瑩,丁虹. 當(dāng)歸多糖對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用[J]. 中國(guó)藥師,2004,7(11):880 - 881.

[19]譚榀新,葉濤,劉湘新,等. 植物提取物抗氧化成分及機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2010,31(15):288 - 292.

[20]鄭瑞生,封輝,戴聰杰,等. 植物中抗氧化活性成分研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(9):85 - 90.