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(1. 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,山東青島 266002; 2. 黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266555)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種具有較強(qiáng)抵抗力的人獸共患病原菌,可導(dǎo)致各種疾病和引起皮膚或器官的多種化膿性感染(故它又名為化膿性葡萄球菌),嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥。我國化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定:在化妝品中不得檢出金黃色葡萄球菌[1]。國內(nèi)外膏霜類化妝品中曾檢出此種細(xì)菌,因此,在化妝品中檢測(cè)葡萄球菌具有重要的衛(wèi)生意義。

目前我國檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌主要采用細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)方法,耗時(shí)長[2],需3 ～ 5d,且檢測(cè)靈敏度較低,易導(dǎo)致漏檢。采用免疫學(xué)檢測(cè)方法如乳膠凝集實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA,enzyme -link immunosorbenr assay),雖可縮短檢測(cè)時(shí)間,但工作原理是抗原抗體的中和反應(yīng),因此會(huì)受到樣品成分及葡萄球菌A蛋白的影響,假陽性高。

焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)是近年來發(fā)明的一項(xiàng)快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地進(jìn)行短片段DNA測(cè)序技術(shù),目前該技術(shù)正廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定[3 - 4]。本研究選取金黃色葡萄球菌保守的nuc基因,以焦磷酸測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序,進(jìn)行基因序列同源性比對(duì),建立準(zhǔn)確檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌的焦磷酸測(cè)序法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株明細(xì)表Table 1 The part list of test strains

SCDLP液體培養(yǎng)基、Baird - Parker平板、血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基 陸橋公司;PCR擴(kuò)增引物:上游引物5′ - GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG -3′;下游引物5′ - TTAACCGTATCACCATCAATCG - 3′,5′端標(biāo)記生物素、焦磷酸測(cè)序引物:5′ - GATTCAA CAGTATATAGTGC - 3′、GelRed染色液、細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×GoTaq Master Mix體系 金斯瑞;電泳緩沖液(1×TAE);瓊脂糖(分析純);6×上樣緩沖液:30mmol/L EDTA、36%(體積分?jǐn)?shù))甘油、0. 05%(質(zhì)量濃度)二甲苯腈藍(lán)FF、0. 05%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán);無菌去離子水;焦磷酸測(cè)序試劑盒:包括焦磷酸測(cè)序用酶、底物及各種dNTP、鏈酶親和素磁珠(Sepharose beads)、綁定緩沖液(Binding Buffer)、復(fù)性緩沖液(Annealing Buffer)、變性緩沖液(Denaturation Buffer)、洗液(Washing Buffer);焦磷酸測(cè)序儀96孔測(cè)序板;微量可調(diào)移液器吸頭。

購買的市售化妝品作為檢測(cè)驗(yàn)證材料:妮維雅潤膚霜、wetcode潔面泡泡、相宜本草潤膚霜、Biore潔面泡沫、卡尼爾嫩白潔面乳、東洋之花補(bǔ)水絲滑乳液、李醫(yī)生亮膚水、相宜本草紅景天幼白精華水、蘭皙高水分乳霜、大寶洗面奶。

5331普通PCR儀 Eppendorf;Centrifuge 5415D離心機(jī) Eppendorf,離心速度12000 r/min以上;PyroMark ID檢測(cè)系統(tǒng) 瑞典Biotage公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 實(shí)驗(yàn)菌株的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)菌株均使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,存放于 - 20℃,以備PCR特異性擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證用。

1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證 提取金黃色葡萄球菌和其它非金黃色葡萄球菌細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),50μL PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0. 5μL,上下游擴(kuò)增引物(20μmol/L)各0. 5μL,dNTPs(10mmol/L)1μL,模板DNA 0. 5μL,雙蒸水補(bǔ)足體積至50μL。

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,40個(gè)循環(huán);72℃延伸5min;4℃保溫。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠(55 ～ 60℃時(shí)加入萬分之一GelRed染色液)。取5 ～ 8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,分別與1μL上樣緩沖液混合進(jìn)行點(diǎn)樣,用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3 ～ 5V/cm恒壓電泳20 ～40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存(圖1)。結(jié)果表明,能夠擴(kuò)增到金黃色葡萄球菌特異性片斷,而其他非金黃色葡萄球菌無特異性片斷。

1. 2. 3 樣品制備和增菌 參照GB 7918. 1和GB 7918. 5進(jìn)行樣品的制備和增菌。

1. 2. 4 可疑菌株分離 應(yīng)用Baird Parker氏培養(yǎng)基或血瓊脂平板,參照GB 7918. 5進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離。

1. 2. 5 PCR擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[5 - 6]。

1. 2. 5. 1 模板DNA提取 挑取1. 2. 3的增菌液或1. 2. 4可疑分離菌株,按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌基因組DNA備用(不能及時(shí)檢驗(yàn),則放置于 - 20±1℃冰箱保存?zhèn)溆?。

1. 2. 5. 2 PCR擴(kuò)增 取0. 5μL 1. 2. 5. 1提取的DNA模板,加入10×PCR緩沖液5μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0. 25μL,20pmol/μL 上下游引物各0. 5μL,DEPC處理水補(bǔ)足體積至50μL。PCR擴(kuò)增分別設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為247bp。

PCR擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性5min,94℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,50個(gè)循環(huán),72℃延伸5min,4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠(55 ～ 60℃時(shí)加入萬分之一的GelRed核酸染色劑)進(jìn)行電泳檢測(cè),3 ～ 5V/cm恒壓電泳20 ～ 40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄保存。

1. 2. 6 焦磷酸測(cè)序 參考文獻(xiàn)[7 - 9]。

1. 2. 6. 1 測(cè)序單鏈模板的制備 將50μL PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔測(cè)序板中,在產(chǎn)物中分別加入磁珠3μL和綁定緩沖液47μL,常溫混勻10min。

打開真空泵,將真空吸附器在超純水中清洗30s后移到96孔測(cè)序板中,抓取與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物,分別在70%乙醇中清洗5 ～ 10s、變性緩沖液中變性5s、洗滌緩沖液中清洗5 ～ 10s。關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中,該板中預(yù)先加入1μL 20pmol/μL測(cè)序引物和44μL退火緩沖液。

將96孔測(cè)序板置80℃烘箱2min后,取出冷卻至室溫進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。

1. 2. 6. 2 焦磷酸測(cè)序反應(yīng) 設(shè)定測(cè)序程序,堿基的加入為ATCG 6 ～ 10個(gè)重復(fù),根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定,由儀器程序自動(dòng)給出),在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP),將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。

測(cè)序反應(yīng)在28±1℃下于焦磷酸測(cè)序儀上進(jìn)行,加樣使用600mbar/8msec的加樣壓力和時(shí)間,每輪反應(yīng)時(shí)間65s。引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸。隨著核酸的結(jié)合,CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào),讀出DNA序列。

1. 2. 6. 3 結(jié)果判定 測(cè)序目標(biāo)序列為:AACTTCAACTAAAAAATTAC。焦磷酸測(cè)序結(jié)果或與測(cè)序結(jié)果目標(biāo)序列不一致,則判斷為陰性。焦磷酸測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致,則判斷為陽性。

1. 2. 6. 4 雜菌干擾實(shí)驗(yàn) 分別吸取1mL 10個(gè)/mL的金黃色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌增菌液至90mL SCDLP中增菌16 ～ 18h進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),各吸取1mL 10個(gè)/mL表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌增菌液至90mL SCDLP增菌做陰性對(duì)照。吸取1mL培養(yǎng)液,提取基因組DNA,進(jìn)行PCR和焦磷酸測(cè)序測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2. 1 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證

對(duì)金黃色葡萄球菌陽性和標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果表明PCR體系能擴(kuò)增到金黃色葡萄球菌特異性片斷,而其他非金黃色葡萄球菌無特異性片斷(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The results of PCRs注:各條帶從左向右依次為DL500、金黃色葡萄球菌:J - 1、J - 2、J - 3、J - 4、J - 5、ATCC6538、表皮葡萄球菌GIMT1. 126、巴氏葡萄球菌GIMT1. 058、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 7644、DL500。

2. 2 特異性和重現(xiàn)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

提取39株金黃色葡萄球菌以及30株非金黃色葡萄球菌的基因組DNA,按照上述PCR檢測(cè)步驟進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示,擴(kuò)增引物針對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性良好,其他菌株DNA沒有擴(kuò)增出目的條帶。

2. 3 雜菌干擾實(shí)驗(yàn)

雜菌干擾結(jié)果表明,PCR引物能夠有效去除雜菌干擾,能夠有效擴(kuò)增出目的片段(圖3)。

2. 4 利用化妝品進(jìn)行方法驗(yàn)證

通過添加不同濃度的金黃色葡萄球菌至化妝品中,根據(jù)GB 7918. 1和7918. 5進(jìn)行樣品的制備和增菌,對(duì)增菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,結(jié)果表明,添加濃度10個(gè)/g(mL)(因樣品的質(zhì)地不同,單位不一樣,潤膚霜用克計(jì)量,亮膚水用mL計(jì)量)以上的增菌液,皆能擴(kuò)增出目的條帶,添加濃度為1個(gè)/g(mL)只有部分能夠擴(kuò)增出來目的條帶,和常規(guī)分離結(jié)果一致;并且只要PCR為陽性的樣品,焦磷酸測(cè)序結(jié)果也為陽性(表2)。

表2 化妝品添加金黃色葡萄球菌方法驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Method validation results in cosmetics added with S. aureus

圖2 金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification results of S. aureaus and other bacteria strain

圖3 雜菌干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Bacterial interference results注:從左到右依次為分子標(biāo)準(zhǔn)DL500、添加干擾菌(干擾菌為表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇異變形桿菌)、純干擾菌、陽性對(duì)照ATCC6538、空白。

注:括號(hào)外結(jié)果為PCR結(jié)果,括號(hào)內(nèi)結(jié)果為焦磷酸測(cè)序結(jié)果。

2. 5 焦磷測(cè)序結(jié)果

對(duì)上述擴(kuò)增結(jié)果為陽性和陰性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表2和圖4):只有PCR結(jié)果為陽性的樣品測(cè)序結(jié)果為陽性,其測(cè)序結(jié)果皆為AACTTCAACTAAAAAATTAC,可確定樣品中檢出金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、添加干擾菌實(shí)驗(yàn)、靈敏度實(shí)驗(yàn)樣品(相宜本草紅景天幼白精華水1個(gè)/mL添加樣品、卡尼爾嫩白潔面乳10個(gè)/g添加樣品)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序結(jié)果表明,能夠快速對(duì)可疑金黃色葡萄球菌進(jìn)行測(cè)序結(jié)果判定。

圖4 部分焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig. 4 A part of pyrosequencing results

3 結(jié)論和討論

病菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法為生化培養(yǎng)法,但隨著各種化妝品安全問題的不斷發(fā)生,生化培養(yǎng)的時(shí)間問題嚴(yán)重影響了檢測(cè)進(jìn)程和結(jié)果判定,因此各種快速檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn),免疫學(xué)法、測(cè)試片法、PCR方法、LAMP技術(shù)等等[9],但這些快檢技術(shù)都存在著自身的不足之處,如,免疫學(xué)方法假陰性高,人為要求操作水平影響較大[10 - 11;測(cè)試片儲(chǔ)存時(shí)間極短,一旦開封剩余測(cè)試片儲(chǔ)存時(shí)間最多兩個(gè)月,且不易保存;PCR 方法存在氣溶膠污染;LAMP方法,易出現(xiàn)假陰性、假陽性的結(jié)果,且結(jié)果不易穩(wěn)定,因此,測(cè)序技術(shù)是目前相關(guān)技術(shù)中最本質(zhì)的從基因序列水平判讀結(jié)果的方法,可靠性大大增強(qiáng)。

本研究采用PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序相結(jié)合的方法,通過采用特異的測(cè)序引物對(duì)金黃色葡萄球菌保守基因nuc基因進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,從而建立化妝品中金黃色葡萄球菌的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法,結(jié)果表明,測(cè)序結(jié)果皆為AACTTCAACTAAAAAATTAC,能快速(4h以內(nèi))可靠地鑒定鑒別金黃色葡萄球菌。焦磷酸測(cè)序檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法吸收了PCR和DNA測(cè)序技術(shù)兩方面的優(yōu)勢(shì),在PCR特異性的基礎(chǔ)上,應(yīng)用很短的一段保守/特異序列的測(cè)定就可滿足對(duì)分子診斷的需要。

本方法建立的焦磷酸測(cè)序體系能夠非常準(zhǔn)確地對(duì)nuc基因進(jìn)行測(cè)序,以此序列對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速鑒定,提高了檢測(cè)的特異性和效率,給出了分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn) - 基因序列,減少了由于PCR敏感性高而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果,提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性,可以對(duì)目標(biāo)生物實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、高通量、準(zhǔn)確鑒定[4]。

[1]GB 7916 - 1987 化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]GB 7918. 5 - 1987 化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 金黃色葡萄球菌[S].

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