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(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,山東濟(jì)南 250353; 2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015; 3. 全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,北京 100015)

葡萄酒中的乙醇是酵母菌利用葡萄漿果中的糖進(jìn)行發(fā)酵的主要產(chǎn)物,乙醇的含量通常為7% ～ 16% vol,一些自然甜型葡萄酒和加強(qiáng)葡萄酒的酒精含量可達(dá)到23%vol。黃酒是世界上最古老的酒類之一,與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒。黃酒中乙醇主要是酵母作糖化劑,利用稻米等原料產(chǎn)生的,黃酒中乙醇含量一般在10% ～ 20% vol。乙醇含量的測(cè)定是酒精飲料質(zhì)量控制的關(guān)鍵之一。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定葡萄酒和黃酒中乙醇的方法主要采用密度瓶法、酒精計(jì)法和氣相色譜法[1 - 4],常見(jiàn)的乙醇快速檢測(cè)方法主要有近紅外光譜法[5 - 6]、分光光度分析法[7]、催化動(dòng)力學(xué)光度法[8 - 9]、熱值分析法[10]、分光光度酶法[11]等。密度瓶法和酒精計(jì)法需對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾,且操作過(guò)程繁瑣;而氣相色譜法存在成本較高、操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn);近紅外光譜法樣品無(wú)需前處理,測(cè)定速度快,但是建模難度大,定標(biāo)樣品的選擇、制備,精確的化學(xué)分析,基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及選擇計(jì)量學(xué)方法的合理性,都將直接影響最終的分析結(jié)果;光度法和熱值分析法準(zhǔn)確度較低。因此,有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的乙醇測(cè)量方法以滿足行業(yè)需求。

生物傳感器(Biosensor)是由具分子識(shí)別功能的生物材料、換能器和信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具。主要原理是利用酶等生物活性物質(zhì)作為傳感器的敏感元件,與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),然后通過(guò)換能器將反應(yīng)轉(zhuǎn)換成可以輸出檢測(cè)的電信號(hào),其大小與待測(cè)物的濃度成正比,通過(guò)分析信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物的定量。生物傳感器分析具有操作簡(jiǎn)單度快、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn),已應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸和葡萄糖[12 - 13]等的快速檢測(cè)。本文采用生物傳感器法對(duì)葡萄酒和黃酒中乙醇的檢測(cè)進(jìn)行研究,建立適合于酒類企業(yè)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程及產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

乙醇氧化酶(EC 1. 1. 3. 13,38units/mg) 購(gòu)于美國(guó)sigma公司;核微孔膜(孔徑0. 2μm,直徑9mm) 美國(guó)Nucleopore公司;王朝干紅葡萄酒(酒精度14% vol);張?jiān)８杉t葡萄酒(酒精度15% vol);長(zhǎng)城干白葡萄酒(酒精度12% vol);石庫(kù)門(mén)上海老黃酒(酒精度≥10%vol);古越龍山五年陳花雕酒(酒精度≥12% vol);戊二醛(40%)、無(wú)水乙醇 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 蒸餾水。

生物傳感分析儀(SBA40C型) 山東省科學(xué)院生物研究所;分析天平(AB - 204N) 梅特勒。

1. 2 檢測(cè)原理

主要原理是利用乙醇氧化酶作為傳感器的敏感元件,與樣品中的乙醇反應(yīng)生成H2O2,在過(guò)氧化氫電極產(chǎn)生電流,其大小與待測(cè)物的濃度成正比,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物的定量[14]。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 固定化乙醇氧化酶膜制備 將5μL乙醇氧化酶滴涂在核微孔基質(zhì)膜(直徑9mm)上形成6mm酶層圓斑,4℃下在戊二醛(40%)蒸汽中交聯(lián)反應(yīng)12h,制成乙醇氧化酶膜[15]。

1. 3. 2 乙醇生物傳感分析儀定標(biāo) 采用20μL/100mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液作為儀器定標(biāo)溶液,取25μL儀器定標(biāo)溶液進(jìn)樣,當(dāng)前后兩次測(cè)定的響應(yīng)值的相對(duì)誤差小于1. 5%時(shí),儀器自動(dòng)定標(biāo)通過(guò),并記錄相應(yīng)的響應(yīng)值。如定標(biāo)未通過(guò),需要再連續(xù)采用定標(biāo)液進(jìn)樣,直至定標(biāo)通過(guò)方可進(jìn)行樣品的測(cè)定。

1. 3. 3 樣品測(cè)定 樣品用0. 1mmol/L,pH7. 2的磷酸緩沖液稀釋1000倍,使乙醇含量在傳感器的響應(yīng)線性范圍內(nèi),然后準(zhǔn)確吸取25μL稀釋后的酒樣注入反應(yīng)池中,記錄測(cè)量結(jié)果,根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算酒樣中乙醇含量。

1. 3. 4 線性范圍 將無(wú)水乙醇用磷酸緩沖液(0. 1mmol/L pH7. 2)配制濃度梯度為2、4、6、8、10、20、40、60、80μL/100mL的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,取25μL配制的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次,以乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),測(cè)量結(jié)果為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍。

1. 3. 5 pH對(duì)酶活的影響 分別采用pH=6. 0、6. 5、7. 0、7. 5和8. 0磷酸緩沖液作為酶膜的介質(zhì),以40μL/100mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液為測(cè)試液(乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與酶膜的介質(zhì)的pH保持一致),記錄乙醇酶膜活性相應(yīng)值,研究介質(zhì)pH對(duì)酶活的影響。

1. 3. 6 方法的加標(biāo)回收率 分別向稀釋1000倍后的酒樣中添加一定濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

1. 3. 7 干擾實(shí)驗(yàn) 黃酒和葡萄酒中其它共存化合物的最高濃度不超過(guò)80g/L[16 - 17],稀釋1000倍后不超過(guò)為80mg/L;而甲醇最高濃度不超過(guò)0. 1g/L[18 - 19],稀釋1000倍后最高為0. 1mg/L,為了考察酒中存在的其他物質(zhì)對(duì)傳感器的影響,實(shí)驗(yàn)分別配制20μL/100mL的乙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、β - 苯乙醇、抗壞血酸的各單組分溶液和0. 2μL/100mL甲醇溶液進(jìn)行測(cè)定,以乙醇的響應(yīng)值為基準(zhǔn)值100%,記錄其它組分的相對(duì)響應(yīng)值。

1. 3. 8 乙醇氧化酶膜穩(wěn)定性研究 將乙醇氧化酶膜安裝在電極上,對(duì)該膜在室溫下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,每次進(jìn)同一濃度的乙醇溶液,連續(xù)測(cè)量13d。

2 結(jié)果與討論

2. 1 線性范圍

由圖1可知,當(dāng)乙醇濃度為2 ～ 80μL/100mL時(shí),乙醇濃度和測(cè)量值具有良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0. 9849x+0. 0202,相關(guān)系數(shù)R2=0. 9997。

圖1 乙醇生物傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of ethanol biosensor

2. 2 pH對(duì)酶活的影響

酶是一種蛋白質(zhì),介質(zhì)的pH會(huì)影響酶的活性,過(guò)酸或過(guò)堿的介質(zhì)會(huì)導(dǎo)致酶的活性下降,甚至失活。pH對(duì)乙醇傳感器酶活的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,pH在7. 0 ～ 7. 5時(shí)乙醇酶膜活性最高,與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致[20 - 21],本實(shí)驗(yàn)選擇pH7. 2的磷酸緩沖液作為乙醇傳感器介質(zhì)溶液和樣品稀釋液。

表1 生物傳感器測(cè)定葡萄酒和黃酒中乙醇的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Recovery test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=3)

表2 生物傳感器測(cè)定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的精密度測(cè)定結(jié)果(n=4)Table 2 Precision test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=4)

圖2 pH對(duì)乙醇氧化酶活性的影響Fig. 2 The effect of pH on alcohol oxidase activity

2. 3 加標(biāo)回收率

如表1所示,乙醇加標(biāo)回收率在99. 22% ～101. 59%之間,表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,可定量檢測(cè)葡萄酒和黃酒中乙醇含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

2. 4 精密度、重復(fù)性測(cè)定

每個(gè)酒樣重復(fù)進(jìn)樣4次,計(jì)算平均值,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,研究了傳感器的重復(fù)性和精密度,結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知,傳感器的精密度和重復(fù)性較好,RSD值小于1%。

2. 5 干擾實(shí)驗(yàn)

由表3可知其樣品中其它共存組分對(duì)乙醇的測(cè)量結(jié)果沒(méi)有影響,說(shuō)明傳感器的抗干擾能力較好。

表4 乙醇傳感器和酒精計(jì)法對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 4 The determination results of samples by ethanol biosensor and alcohol meter method(n=6)

注:表中數(shù)值是已按稀釋比例換算成的實(shí)際乙醇濃度。

表3 乙醇傳感器的抗干擾性(n=3)Table 3 The anti - interference performance of ethanol biosensor(n=3)

2. 6 酶膜穩(wěn)定性研究

如圖3所示,酶電極在室溫下13d后酶電極的響應(yīng)值仍剩初始值的76%,并且對(duì)同一濃度的乙醇溶液連續(xù)測(cè)量6次,RSD值為4. 61%,說(shuō)明乙醇氧化酶膜可在室溫下,13d內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性。

圖3 乙醇傳感器的穩(wěn)定性Fig. 3 The stability of ethanol biosensor

2. 7 乙醇傳感器法和酒精計(jì)法間的比較

利用乙醇傳感器法和國(guó)標(biāo)酒精計(jì)法分別對(duì)3種葡萄酒和2種黃酒進(jìn)行分析,結(jié)果如表4所示,并對(duì)兩種方法測(cè)量的結(jié)果進(jìn)行t - 檢驗(yàn),得到的p值大于0. 05,說(shuō)明兩種方法測(cè)量結(jié)果無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論

本文建立了乙醇生物傳感器法測(cè)定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的方法,該方法的線性范圍為2 ～80μL/100mL,精密度和重復(fù)性RSD小于1. 0%,加標(biāo)回收率在99. 22% ～ 101. 59%之間,且具有很好的抗干擾能力,與酒精計(jì)法測(cè)定結(jié)果相關(guān)性良好,用t - 檢驗(yàn)分析,無(wú)顯著性差異。本方法的建立為酒類企業(yè)的產(chǎn)品快速檢驗(yàn)或酒類生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制提供有效的途徑。

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