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(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海 201306)

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛分布于溫?zé)釒У貐^(qū)的近海海水、海底沉積物和魚貝類等海產(chǎn)品中。該菌是一種人畜共患菌,它能引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病的發(fā)生,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[1],同時(shí)也是人類食源性疾病重要病原之一。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地區(qū)頻繁發(fā)生,以沿海城市為主[2]。它是亞洲許多國(guó)家引起食源性腸胃炎的主要病原菌[3]。我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)資料顯示[4 - 5],副溶血性弧菌食物中毒居細(xì)菌性食源性致病之首?？股赝ǔ１徽J(rèn)為是治療此類疾病的良好藥劑,但隨著抗生素的大量使用該菌的耐藥性不斷增加[6]。

1996年,美國(guó)食品及藥品管理局(FDA),疾病預(yù)防和控制中心(CDC)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)建立了國(guó)家耐抗菌素監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(NARMS)。表明微生物耐藥性是一個(gè)日趨嚴(yán)重的問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)在2011年4月7日的世界健康日中強(qiáng)調(diào)微生物耐藥性的重要性[7],呼吁積極采取措施應(yīng)對(duì)微生物耐藥性。我國(guó)是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國(guó)家之一,耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)已占住院感染總?cè)藬?shù)的30%左右。然而,各相關(guān)部門對(duì)食源性病原微生物抗菌藥耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究工作基本上沒有開展[8]。

因此,本研究的主要目的是,通過不同溫度下不同耐藥性致病副溶血性弧菌生長(zhǎng)特性的比較,為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。同時(shí),對(duì)這些菌株進(jìn)行ERIC - PCR分子分型,從基因型角度分析其變異性,另外,一級(jí)生長(zhǎng)模型的建立,為以后的耐藥性副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯,TCBS培養(yǎng)基,Luria - Bertani營(yíng)養(yǎng)肉湯,Luria - Bertani營(yíng)養(yǎng)瓊脂 均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Mueller Hinton Agar(MHA) 英國(guó)OXOID。

抗生素:阿莫西林 - 克拉維酸(Amoxicillin - clavulanic acid)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢他啶(Ceftazidime)阿米卡星(Amikacin)、慶大霉素(Gentamicin)、四環(huán)素(Tetracycline)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氯霉素(Chloramphenicol),復(fù)方新諾明(Trimethoprim -Sulfamethoxazole) 均由英國(guó)OXOID公司生產(chǎn)。

MLS - 3750型高壓滅菌鍋 三洋電機(jī)生物醫(yī)藥株式會(huì)社;SW - CJ - 1FD 系列超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;GHP - 9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;Bioscreen FP - 1100C型全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭,Oy Growth Curves Ab Ltd公司。

1. 2 菌株的獲得

菌種:實(shí)驗(yàn)用的副溶血性弧菌菌株信息見表1,并經(jīng)過PCR檢測(cè)其致病基因tdh,trh(方法參照GB/T4789. 7 - 2008,FDA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9)。獲得的8株含有tdh基因的菌株用25%的甘油管保存,一份置于- 20℃冰箱保存待用,一份置于 - 80℃冰箱保存。

1. 3 藥敏實(shí)驗(yàn)

菌株活化:將副溶血性弧菌菌株從 - 20℃保存的甘油管中經(jīng)活化后劃線至TCBS平板,37℃培養(yǎng)18 ～24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3%NaCl,pH8. 0)中,放入搖床中,37℃,150r/min,培養(yǎng)18h,同時(shí),三株質(zhì)控菌EscherichiacoliATCC25922、StaphylococcusaureusATCC25923和PseudomonasaeruginosaATCC27853經(jīng)活化后劃線至LBA平板,37℃培養(yǎng),挑去單菌落至LB中搖床培養(yǎng)18h。

藥敏實(shí)驗(yàn):按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)規(guī)定[9],K - B紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的副溶血性弧菌菌株耐藥性進(jìn)行測(cè)定。首先將菌液調(diào)至濁度為1. 5×108cfu/mL(OD值約為0. 13),用棉拭子蘸取一定量的菌液均勻涂布到約4mm厚度的MHA平板上,待干后,將帶有特定濃度的藥敏紙片貼于平板上。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h測(cè)量抑菌圈的直徑。副溶血性弧菌的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1. 4 生長(zhǎng)參數(shù)的獲得

1. 4. 1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將副溶血性弧菌菌株從- 20℃保存的甘油管中活化后,劃線至TCBS平板,37℃培養(yǎng)18 ～ 24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3% NaCl,pH8. 0)中,放入搖床中,37℃,150r/min,培養(yǎng)18h,菌株生長(zhǎng)到達(dá)指數(shù)后期(109CFU/mL),以此為初始接種液。

采樣梯度稀釋法:在Bioscreen配套的100微孔板中進(jìn)行梯度稀釋。吸取初始接種液20μL接種至第一孔180μL TSB中,以此為第一稀釋梯度。用移液器吹吸混勻后,再從這個(gè)孔中吸取20μL接種至第二孔180mL TSB中,依次梯度稀釋到第5孔(104CFU/mL)TSB中,按相同方式做兩個(gè)平行,將加好菌液的100孔板放入Bioscreen的樣品槽中,Bioscreen的設(shè)置為每30min讀取一次,中速震蕩,吸光度為420 ～ 580nm的寬波段,培養(yǎng)溫度分別為20,25,37℃,分別測(cè)定這三個(gè)溫度下的生長(zhǎng)曲線,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

生長(zhǎng)曲線擬合分析采用OriginPro 8軟件,生長(zhǎng)參數(shù)數(shù)據(jù)比較采用SPSS17. 0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表2 藥敏紙片的中英文名稱及劑量Table 2 Chinese name and English name of antibiotic disk and its dose

表3 8株菌株的耐藥結(jié)果Table 3 Results of antibiotic resistant of 8 strains

注:R表示耐藥;S表示敏感;I表示中介。

1. 4. 2 應(yīng)用微生物預(yù)測(cè)模型 采用修正的Gomperz growth model(1)[10],用OriginPro8軟件擬合方程如下

y=α0+(α - α0)×exp( - exp(1+μmax×2. 72×((λ - t)/(α - α0))))

(1)

初始OD值為α0=0. 12為104菌量時(shí)的OD值。α代表最大的生長(zhǎng)的OD值,λ代表延滯期(h),μmax表示最大比生長(zhǎng)速率(h-1)

1. 5 ERIC - PCR 比較菌株的差異性

ERIC - PCR擴(kuò)增引物[11]Eric1:5′ - TAAGCTCC TGGGATTCAC - 3′、Eric2:5′ - AAGTAAGTGACTGGGG TGAGCG - 3′,由上海生物工程有限公司合成;PCR體系為:12. 5μL的TaKaRa公司的Mix,引物(10μmol/L)各1μL、200ng DNA模板,用經(jīng)滅菌的去雙蒸水補(bǔ)齊25μL。ERIC - PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性 95℃ 7min、變性 94℃ 1min、退火52℃ 1min、延伸65℃ 8min、總延伸65℃ 16min、10℃保存、30個(gè)循環(huán)。使用1. 5%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,緩沖液為1×TAE,以120V恒壓電泳,電泳約60min后使用溴化乙錠染色15min后進(jìn)行成像觀察并保存。

ERIC - PCR圖譜分析以分子量大小相同的條帶作為相同性狀,陽性結(jié)果記為1,陰性結(jié)果記為0,使用Gel - pro 4. 5軟件分析,將輸出的結(jié)果以Dice為系數(shù)采用非加權(quán)平均法(UPGMA)利用SLT - Ntsy -2. 10e軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 8株致病性副溶血性弧菌的耐藥性分析

采用K - B紙片擴(kuò)散法,從8株含tdh基因的致病性副溶血性弧菌中檢出6株耐藥菌株Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16,Vp 17,Vp 18。其中Vp 8耐慶大霉素,Vp 5、Vp 14、Vp 17均只耐阿米卡星,Vp 16耐阿米卡星和慶大霉素,Vp 18菌株耐阿米卡星,環(huán)丙沙星,和左氧氟沙星。圖1為Vp 2對(duì)AMC、AK、CTX的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果,具體結(jié)果見表3。

圖1 Vp2對(duì)AMC、AK、CTX的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of antibiotic resistant test of Vp2 to AMC、AK、CTX

2. 2 8株致病性副溶血性弧菌的生長(zhǎng)特性比較分析

表4 8株副溶血性弧菌用modified Gompertz模型擬合的生長(zhǎng)參數(shù)擬合結(jié)果Table 4 Fit of growth parameters for 8 V. parahaemolyticus strains by modified Gompertz model

通過Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定這8株菌生長(zhǎng)過程的比濁度,用修正的Gompertz擬合測(cè)定的數(shù)據(jù)。

修正的Gompertz模型擬合結(jié)果R2均在0. 98以上,MSE均小于等于0. 003,可知修正的Gompertz模型適合擬合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由表4及圖2修正的Gompertz的擬合結(jié)果可知,20℃時(shí)Vp 18菌株的生長(zhǎng)最快,方差分析可知,與Vp5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05)與Vp 16,Vp 17,Vp 21不存在顯著性差異(p>0. 05),Vp 17次之,僅與Vp 2存在顯著性差異,Vp5生長(zhǎng)最慢,但其僅與Vp 18有顯著性差異;8株菌的延滯期無顯著性差異(p>0. 05);Vp2的最大生長(zhǎng)量最大,但與Vp5沒有顯著性差異(p>0. 05),與其他的菌株都有顯著性差異(p<0. 05)。Vp18的最大生長(zhǎng)量最小,與Vp2和Vp5有顯著性差異(p<0. 05),與其他的菌株均無顯著性差異(p>0. 05)。

25℃時(shí)Vp 18菌株生長(zhǎng)最快,與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05),與Vp16,Vp17,Vp21不存在顯著性差異(p>0. 05),Vp 17次之,除了與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2有顯著性差異外,與其他菌株均無顯著性差異,而Vp 2最慢,與Vp 18,Vp17,Vp16,Vp21存在顯著性差異;Vp 5的延滯期最短,只與Vp 2有顯著性差異(p<0. 05),而Vp 2的延滯期最長(zhǎng),與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16有顯著性差異,而與其他幾株菌無顯著差異(p>0. 05);Vp2的最大生長(zhǎng)量最大,與其他菌株均有顯著性差異(p<0. 05),Vp 8的最大生長(zhǎng)量最少,與其他菌株無顯著性差異(p>0. 05)。

37℃時(shí)8株菌的最大比生長(zhǎng)速率無顯著性差異(p>0. 05);Vp 2的延滯期最長(zhǎng),且與其他的菌株有顯著性差異(p<0. 05),而其他幾株菌間無顯著性差異(p>0. 05);Vp 2的最大生長(zhǎng)量最大,與Vp 8和Vp 18存在顯著性差異(p<0. 05),與其余菌株均無顯著性差異(p>0. 05),Vp 18的最大生長(zhǎng)量最少,與Vp 2和Vp 21存在顯著性差異(p<0. 05),與其余菌株均無顯著性差異(p>0. 05)。

綜上,不同耐藥致病副溶血性弧菌菌株的生長(zhǎng)參數(shù)存在一定的差異性,但是菌株的各個(gè)生長(zhǎng)參數(shù)的大小與菌株的耐藥性的程度之間沒有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。且發(fā)現(xiàn)一株三重耐藥性菌株Vp 18與另外一株敏感性副溶血性弧菌Vp 5在20℃和25℃下的最大比生長(zhǎng)速率有顯著差異,其他菌株無顯著差異。

圖2 8株副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線及其用modified Gompertz模型擬合結(jié)果Fig. 2 The growth curves and fitting curves of 8 V. parahaemolyticus strains by modified Gompertz model

2. 3 8株致病性副溶血性弧菌的ERIC - PCR 圖譜分析

由圖3,條帶的條數(shù)及位置獲得的聚類分析圖譜可知,耐藥性菌株Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 16有100%的相似性。此4株菌株與非耐藥性菌株Vp 21有89%的相似性,耐藥菌株Vp 18與非耐性菌株Vp 2有89%的相似性。在相似系數(shù)0. 86處,此八株菌株可以分為兩大類,Vp5,Vp 8,Vp 14,Vp 16與Vp21和 Vp17歸為一類,Vp 18與V p2為一類。ERIC - PCR 是一種有效的細(xì)菌基因分型方法,能夠精確確定菌株間的親緣關(guān)系[12],為菌株的差異性比較提供了基因型信息。ERIC - PCR圖譜與菌株的耐藥性沒有明顯的對(duì)應(yīng)性。

圖3 8株菌的ERIC圖譜及擴(kuò)增條帶的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析Fig. 3 UPGMA dendrogram illustrated the clustering of amplification patterns of the 8 V. parahaemolyticus isolates with ERIC - PCR

3 結(jié)論

本文比較了耐藥性致病副溶血性弧菌與非耐藥性致病副溶血性弧菌的生長(zhǎng)差異。并用修正的Gomperz growth model擬合了此8株耐藥性菌株與非耐藥性菌株在20、25、37℃下,在TSB(含3%NaCl)中的生長(zhǎng)曲線。

在37℃適宜溫度下,八株菌的最大比生長(zhǎng)速率無顯著性差異(p>0. 05),而在20℃和25℃條件下,Vp 18生長(zhǎng)最快與Vp 5,Vp 8,Vp 14,Vp 2均存在顯著性差異(p<0. 05)。與Lianou[13 - 14]等報(bào)道的結(jié)果一致,說明溫度會(huì)影響副溶血性弧菌的μmax間的差異,差異性隨著溫度的降低而增高。

三重耐藥的致病副溶血性弧菌Vp 18的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于非耐藥性菌株Vp 2,說明耐藥性與菌株的生長(zhǎng)快慢有一定的聯(lián)系,可能由于菌株的生長(zhǎng)速率快,產(chǎn)生變異性的可能性大,獲得耐藥性的概率也隨之增大。菌株之間的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變異性將會(huì)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的準(zhǔn)確性帶來影響[15],此結(jié)果可為耐藥性副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。

耐藥性致病副溶血性弧菌Vp 18與非耐藥性致病性副溶血性弧菌Vp 2的ERIC - PCR圖譜歸為一類,表明這兩株菌的亞型相似,也說明耐藥性基因可能來自質(zhì)粒上,這也為副溶血性弧菌的耐藥機(jī)制的研究提供了一定的參考。

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