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(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500;2.昆明理工大學(xué)云南道地藥材研究開發(fā)中心,云南昆明 650500)

γ-氨基丁酸(簡稱GABA),是一種四碳非蛋白氨基酸,廣泛存在于動植物中。據(jù)文獻(xiàn)記載,早在1949年就從土豆中發(fā)現(xiàn)了GABA,1950年又在動物大腦中發(fā)現(xiàn)GABA,而在1983年則首次用化學(xué)合成的方法制備了GABA[1-5]。在神經(jīng)中樞中,1/3的神經(jīng)突觸部位都是以GABA為遞質(zhì),與大腦皮質(zhì)、垂體、下丘腦、生殖器官、肝臟和腎臟等存在著密切的關(guān)系,它于人體存在諸多益處,如對心肺血管有直接或間接作用,調(diào)節(jié)血壓與心率;營養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,促進(jìn)膜蛋白的合成;廣泛應(yīng)用于癲癇、帕金森、亨廷頓氏病等疾病的治療;促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝,提高腦活力;抑制谷氨酸脫羧反應(yīng),降低血氨,保護(hù)肝臟;降低神經(jīng)元活性,鎮(zhèn)靜神經(jīng),抑制焦慮等癥;還具有保護(hù)腎臟、抗衰老、促進(jìn)生長激素分泌、預(yù)防肥胖、促進(jìn)酒精代謝等功效[1,6-11]。近年來,GABA的相關(guān)研究變得越來越熱門,2009年衛(wèi)生部批準(zhǔn)其為新資源食品,它將會成為21世紀(jì)新資源食品的生產(chǎn)原料之一[12-13]。因此,GABA的制備純化、檢測方法與綜合開發(fā)利用等相關(guān)研究已被人們普遍關(guān)注,大量的制備方法和檢測技術(shù)應(yīng)用于此類研究中,且仍在不斷的改進(jìn)中。其中一些新技術(shù)具有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展?jié)摿屯茝V價值,本文針對近年來GABA的制備方法和含量檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 制備方法

GABA的別名為氨酪酸或哌啶酸,化學(xué)名為4-氨基丁酸,其結(jié)構(gòu)如圖1所示,分子式為NH2CH2CH2CH2COOH,分子量為103.1。易溶于水,微溶于熱乙醇溶液,不溶于乙醚等有機(jī)試劑。熔點(diǎn)為202℃,在高于熔點(diǎn)溫度的情況下,分解為水和吡咯烷酮。目前,GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、植物富集法等。

圖1 γ-氨基丁酸(GABA)化學(xué)結(jié)構(gòu) Fig.1 The chemical structure of γ-aminobutyric acid(GABA)

1.1 化學(xué)合成法

表1 GABA化學(xué)合成制備方法Table 1 Chemical synthesis methods of GABA

化學(xué)合成法成本高產(chǎn)率低,在生產(chǎn)過程中涉及到危險有毒溶劑,而且存在化學(xué)成分殘留,因此使用范圍存在局限性,不能用于食品、藥品等方面。目前,化學(xué)制備方法主要包含8種化學(xué)反應(yīng)(見表1)。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用生物發(fā)酵技術(shù),通過篩選優(yōu)良、高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌種,發(fā)酵生產(chǎn)GABA,該方法對生產(chǎn)設(shè)備要求高,且對環(huán)境要求比較嚴(yán)格,產(chǎn)品純度不高,但是可以用作天然食品藥品添加劑,對生物體傷害遠(yuǎn)比化學(xué)合成法低。它在食品等工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛、歷史悠久,最早利用大腸桿菌脫羧酶生產(chǎn)GABA,但是因其存在安全隱患,無法應(yīng)用于食品、藥品生產(chǎn)中[14]。隨著綠色食品的不斷開發(fā),后被乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等微生物所取代,催化谷氨酸脫羧,制備GABA,具有成本低、產(chǎn)量高、安全等優(yōu)點(diǎn),且已逐步走入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段,其中乳酸菌是一種食品安全級(GRAS)的微生物,因其具有安全、高效等諸多優(yōu)點(diǎn),被譽(yù)為重要的益生菌,具有很大的潛在價值。乳酸菌的來源豐富,可以從韓國泡菜、酒糟、乳酪發(fā)酵劑、發(fā)酵黃漿水中分離獲得[14，20-21]。Noriko Komatsuzaki等人在2005年對Lb.paracasei NFRI 7415進(jìn)行研究,最終能積累產(chǎn)生30g/L的GABA[22]。吳非等人改良以保加利亞乳桿菌L2為菌種生產(chǎn)GABA的方法,比之前產(chǎn)量分別提高了25.63%和30.77%[23]。許建軍等人通過研究生物發(fā)酵生產(chǎn),以乳酸菌和酵母菌混合物作為菌種,以L-谷氨酸鈉為轉(zhuǎn)化底物制備GABA,濃度高達(dá)300～500mg/100mL[24]。黃俊等人從未滅菌的生牛奶中篩選出高產(chǎn)GABA的乳酸菌Lactobacillus brevis CGMCC-1306,所得GABA的含量高達(dá)76.36g/L[14]。

1.3 植物富集法

植物富集法是用現(xiàn)有的提取技術(shù),對含有GABA的植物進(jìn)行分離純化,成本低,產(chǎn)品純度較高,相對于微生物發(fā)酵方法,它對生產(chǎn)環(huán)境要求較低,又比化學(xué)合成法安全。目前從植物中制備GABA常用的方法主要可以分為溶劑萃取法、柱分離制備法等。

1.3.1 溶劑萃取法 一種是選取水/醇為提取劑,利用GABA在植物和水/醇中溶解度或分配系數(shù)的不同能使GABA從植物內(nèi)轉(zhuǎn)移到水/醇中的原理,經(jīng)過反復(fù)萃取,可將絕大部分的GABA提取出來。在提取過程中可分為靜置提取和超聲提取,通常超聲提取的產(chǎn)率比靜置提取產(chǎn)率高。其中固液比一般在1∶1～1∶30,提取溫度為40～70℃,提取時間為靜置2～5h或者超聲20～90min,提取1～3次,過濾留濾液,分離純化,經(jīng)茚三酮溶液定性檢測或經(jīng)其他儀器定量檢測,濃縮干燥即得[25-28]。沈強(qiáng)等人采用水提法,超聲提取茶葉中GABA[25]。黃美娥等人以南瓜為原料,選取20%乙醇為溶劑,料液比為1∶17(w/v),提取1h,得到的產(chǎn)率為209mg/100g[28]。水/醇提取法為最常用的溶劑提取方法,所得GABA純度較高,但操作過程較為繁瑣。其中醇提法提取GABA含量低于水提法,提取成本高于水提法,不過因醇溶劑具有易揮發(fā)等優(yōu)點(diǎn),也被人們廣泛使用。

另一種是選取鹽溶液等溶劑提取GABA,如磺基水楊酸、檸檬酸緩沖鹽、碳酸鈉-碳酸氫鈉等。錢愛萍等人選取5%磺基水楊酸,在適宜的條件下提取過濾,所得GABA含量高達(dá)98.48%,比鹽酸水解法提高13.54%～13.77%,比醇提法提高7.42%～8.06%,且方法穩(wěn)定簡單[29]。而廖周華等人使用的檸檬酸緩沖鹽為介質(zhì),從麥麩中提取GABA[30]。李炳坤等人從桑葉中提取GABA,則選用2.4mmol/L碳酸鈉-2.4mmol/L碳酸氫鈉作為介質(zhì)[31]。此法處理簡單、快速,且在使用離子色譜檢測時,能消除水提法中水所帶來影響實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)度的負(fù)峰。但是使用碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液時,溫度不宜過高,因?yàn)樘妓釟溻c受熱易分解。

1.3.2 柱分離制備法 柱分離制備法也稱為柱色譜法,根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同,進(jìn)行梯度洗脫,從而分離的一種層析法,一般選用樹脂、硅膠、活性炭等柱填充材料進(jìn)行分離。嵇豪等人用D101樹脂柱對紅曲發(fā)酵液進(jìn)行分離洗脫,最終GABA的總得率為45.4%[32]?；钚蕴课椒ㄊ且环N特殊柱分離制備方法?；钚蕴渴且环N多孔性的含炭非極性分子物質(zhì),易于吸附非極性或極性很低的吸附質(zhì),具有高度發(fā)達(dá)的孔隙構(gòu)造,增大了與物質(zhì)充分接觸的表面積,產(chǎn)生極強(qiáng)的吸附作用。在甘蔗梢中提取氨基酸時就采用活性炭吸附法,在50～90℃的情況下動態(tài)吸附,然后用0.5～2.0mol/L氨水和30%～90%乙醇動態(tài)洗脫[33]。該方法能讓原材料體現(xiàn)物盡其用的含義,節(jié)約了操作時間,而且降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生,對操作環(huán)境也有所降低。

1.3.3 鹽酸水解法 鹽酸水解法[34-35]是檢測氨基酸的常規(guī)方法即國標(biāo)法,在GB/T5009.124-2003、GB/T 18246-2000等國標(biāo)中均有涉及,具有廣泛認(rèn)可性。其基本原理是植物中的蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解為游離的氨基酸,經(jīng)離子交換柱分離,茚三酮溶液定性檢測,再通過分光光度計(jì)比色確定其GABA含量,其最低檢出限為10pmol,但是存在局限性,不適用于檢測蛋白質(zhì)含量低的植物。

1.3.4 膜分離技術(shù) 膜分離技術(shù)是利用選擇性透過膜,借助于外界能量或化學(xué)位差的推動,由于膜兩側(cè)推動力不同,液體中物質(zhì)選擇性的透過,以達(dá)到進(jìn)行分離純化的目的。馮骉等人在早前建立了間歇稀釋過濾和連續(xù)稀釋過濾兩種的數(shù)學(xué)模型,回收率高達(dá)95%[36]。分離GABA通常采用超濾與納濾相結(jié)合的方法獲得濃度和純度都較高的GABA,但是該方法具有分離膜易受污染、膜種類少、易產(chǎn)生濃度極化現(xiàn)象等缺點(diǎn)[37]。

2 含量測定方法

GABA在常溫下為小葉狀或針狀白色結(jié)晶,微臭,易潮解,在干燥條件下穩(wěn)定性強(qiáng)。但是GABA無紫外吸收,在建立檢測方法時,存在一定局限性,諸多方法均需經(jīng)過衍生過程才能檢測。目前,測定GABA含量的方法有比色法、電泳法、色譜法、氨基酸分析儀等。

2.1 比色法

此法利用紫外可見分光光度計(jì)法測定待測物含量,其原理是根據(jù)各物質(zhì)對不同波長處的輻射吸收程度不同而測量。最通用的方法當(dāng)屬茚三酮反應(yīng),即在加熱條件及弱酸環(huán)境下,加入適量2%茚三酮溶液,氨基酸可與2,2-二羥基-1,3-茚三酮反應(yīng)生成有色化合物,是一種可定量的顯色反應(yīng)。所呈現(xiàn)的顏色一般為紫藍(lán)色,但是隨反應(yīng)的條件不同而不同(酸度、溫度、離子等)[38]。而陳恩成等人基于Berthelot顯色反應(yīng),研究出使用紫外可見分光光度計(jì)快速測定GABA含量的比色法,以重蒸苯酚和次氯酸鈉溶液作為顯色劑顯色反應(yīng),在645nm處測定其含量[39]。該方法操作簡單、檢測速度快、重現(xiàn)性好,適合于測定多種植物中GABA的含量,但對操作過程要求高,且不能存在氨及銨鹽,避免干擾。

2.2 放射性免疫法

1959年,Yalow和Berson創(chuàng)建了放射性免疫法,它是一種超微量測定的體外放射分析技術(shù)。之后被用于GABA的含量檢測中,綜合了放射性元素的靈敏性和免疫反應(yīng)的特異性,利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原,與GABA偶聯(lián)結(jié)合,經(jīng)放射確定其含量[40]。此法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便,但是受藥盒時間限制,存在局限性。

2.3 紙上電泳法

紙上電泳法是以紙為基板,在外加電場的作用下,待測物從一側(cè)定向移動到另一側(cè),由于物質(zhì)大小差異導(dǎo)致移動速度存在差異,從而達(dá)到分離的作用。湯茶琴等人利用此法對茶葉中GABA含量進(jìn)行檢測,能較好分離且斑點(diǎn)清晰,與氨基酸自動分析儀法的測試結(jié)果相比較,兩者間無明顯差異。它有高效、可回收、靈敏度高、低成本等優(yōu)點(diǎn),但是耗電、操作繁瑣、需控制溫度pH等多因素影響[41]。

2.4 酶聯(lián)熒光法

此法又稱ELISA法,用于GABA定量測定,根據(jù)抗原與抗體的特異反應(yīng),與酶連接的待測物與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。胡紅焱與楊樹德利用GABA酶偶聯(lián)細(xì)菌熒光酶生物發(fā)光系統(tǒng)建立GABA的定量檢測法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),線性范圍大,精密度低[41-42]。

2.5 色譜法

2.5.1 紙層析法 紙層析法,是一種以紙為載體的色譜法,依據(jù)極性相似相溶的原理,以紙纖維上吸附的水分或其他緩沖鹽等作為固定相,以不與水相溶的有機(jī)溶劑作為流動相。用一定比例的展開劑從點(diǎn)樣的一段進(jìn)行展開,由于待測樣中各物質(zhì)分配系數(shù)不同,擴(kuò)散速度不同,從而達(dá)到分離的目的。Wang Q X等人對天然產(chǎn)物進(jìn)行檢測,最終確定展開劑最佳比例為正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶2,顯色劑為0.4%茚三酮溶液,以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照品[43]。此法操作簡便、成本較小,但是精準(zhǔn)度不高,只能用于定性檢測,不如高效液相色譜法應(yīng)用普遍。

2.5.2 薄層色譜法 薄層色譜法是一種氨基酸定性快速檢測的方法,能夠辨別氨基酸種類,其原理與紙層析法相同,均是依據(jù)相似相容的原理。對于薄層色譜測定方法,楊四潤等人建立了薄層色譜檢測方法對茶葉中GABA含量進(jìn)行檢測,認(rèn)為正丁醇∶冰醋酸∶水比例為4∶2∶1的展開劑分離效果較好,能達(dá)到最低檢測限為0.03mg/mL[44]。此法易于操作、快速、低成本,但是無法準(zhǔn)確計(jì)算待測物含量,故只能用于定性分析。

隨著科技發(fā)展,在薄層色譜法的基礎(chǔ)上結(jié)合薄層掃描儀建立了一種定量方法——薄層掃描法(簡稱TLCS),又名原位定量薄層色譜。黃美娥等人就采用反射雙波長(λs=515nm;λr=680nm)線式掃描對南瓜中GABA含量進(jìn)行定量分析[28]。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確,精密度高,重復(fù)性好,在0.125～2.0mg/mL間線性關(guān)系良好,可用于GABA的痕量檢測。

2.5.3 高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法是以不同極性(甲醇、乙腈、水、醋酸鈉緩沖鹽等)且按一定比例混合的溶液為流動相,高壓輸送流經(jīng)裝有固定相的色譜柱,進(jìn)行梯度洗脫,各成分極性不同,因而洗脫時間不同,從而被分離開,在254～360nm紫外檢測波長下進(jìn)行檢測分析。進(jìn)樣量為μL數(shù)量級,具有高速、高效、高靈敏度、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn),應(yīng)用廣泛。因GABA無紫外吸收且酸性極強(qiáng),需經(jīng)過柱前衍生過程才能檢測,所用的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)、異硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)。其中OPA衍生法步驟簡單、反應(yīng)快速、過量試劑不干擾結(jié)果,但是衍生物不穩(wěn)定,不易放置太久;PITC衍生法所得衍生物穩(wěn)定,但需在無水條件下進(jìn)行,容易影響分析柱使用壽命;FDNB衍生法能得到較為穩(wěn)定的衍生物,但是反應(yīng)副產(chǎn)物會干擾檢測結(jié)果;AQC衍生法制取穩(wěn)定的衍生物且副產(chǎn)物不影響結(jié)果。Clark G等人選用OPA作為衍生化試劑,在338nm下檢測含量[45]。孫蓮等人則選用的衍生化試劑為PITC,在254nm下檢測桑葉中GABA含量[46]。而且PITC衍生法早在1996年就已得到國內(nèi)業(yè)界認(rèn)可,被列入氨基酸分析方法通則[47]。

2.5.4 GC-MS法 GC-MS法又稱氣相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法,當(dāng)待測物進(jìn)入氣相,被氣化吸附在固定相上,因?yàn)槲侥芰Σ煌?所以出峰時間不同,樣品在進(jìn)入質(zhì)譜之后在離子源中電離,生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子,經(jīng)加速電場的作用,形成離子束,進(jìn)入質(zhì)量分析器。此法分離效果好,靈敏度高,檢測限寬,適合于揮發(fā)性物質(zhì)痕量分析,但是檢測儀器價格昂貴,操作較為復(fù)雜。因?yàn)镚ABA揮發(fā)性小,所以需要衍生化才能進(jìn)行檢測,衍生化試劑較常見的有硅烷化試劑、烷基氯甲酸酯類試劑等,衍生化反應(yīng)時間短,但衍生過程復(fù)雜,不易操作。其中硅烷化試劑在GC-MS分析中應(yīng)用最廣,反應(yīng)性強(qiáng),衍生物揮發(fā)性好,但遇水或酸不穩(wěn)定,易污染FID檢測器,最常見的是MTBSTFA(N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺)、MSTFA(N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)、BSTFA(雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)等;而烷基氯甲酸酯類試劑的衍生反應(yīng)產(chǎn)率高,速度極快,但其過量試劑及副產(chǎn)物可干擾結(jié)果,必須除去。Paul L Wood和Damien Richard等人均選取了MTBSTFA作為衍生化試劑[48-49]。

2.6 氨基酸分析儀法

氨基酸自動分析儀測定氨基酸是國標(biāo)采用的方法之一[34],得到業(yè)界廣泛認(rèn)可。其測定原理是因待測樣品中含有的各種氨基酸的結(jié)構(gòu)、酸堿性、極性及分子大小均有差異,利用陽離子交換柱將它們分離,經(jīng)緩沖液梯度洗脫,茚三酮進(jìn)行顯色反應(yīng),測定其含量。任紅波使用日立835-30型氨基酸分析儀,僅用20min就測定糙米中的GABA[50]。分析儀靈敏度高,最小檢出限可達(dá)1pmol,重現(xiàn)性好且高效,被廣泛普及到氨基酸的檢測中,無需前期處理,可用于大批量檢測。

2.7 毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測法

孔令瑤等人采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(CE-ED)的方法對發(fā)芽黑米胚芽中GABA含量進(jìn)行檢測,選取鄰苯二甲醛(OPA)為柱前衍生化試劑[51]。該方法檢測時間短、靈敏度高、重現(xiàn)性好,但是操作過程復(fù)雜,就目前而言CE-ED法在檢測GABA含量中使用較少。

綜上所述,雖然已有很多制備與檢測方法,但對于藥食同源的GABA來說,又要區(qū)分開藥品與食品的定義,在食品中添加GABA,不能像藥品一樣進(jìn)行簡單添加,更多地考慮其安全、環(huán)保等因素,從源頭開始控制,從天然物質(zhì)中獲取,生產(chǎn)出食品級GABA,目前,其制備方法漸漸由化學(xué)合成法轉(zhuǎn)向從自然界中獲取,其中微生物發(fā)酵法較為成熟,得率較高,已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化[14]。就中國而言,植物資源非常豐富,而已開發(fā)的資源較為局限,現(xiàn)今植物原料中GABA含量低,提取成本較高且純化難度高,多數(shù)原料不適宜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,可見植物富集法具有很大的潛在發(fā)展前景。日本和臺灣均已將GABA列為食品級,而我國也于2009年將GABA列為新資源食品,這對GABA的檢測方法拋出了又一嶄新的問題。產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化、市場的規(guī)范化都需要快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測方法作為支撐?，F(xiàn)今這些檢測手段仍需優(yōu)化,大量檢測方法操作過程復(fù)雜且耗時長,檢測儀器昂貴無法普及。

3 展望

隨著人們步入屬于生命科學(xué)時代的21世紀(jì),越來越多的人開始關(guān)注自己的健康,越來越多的目光開始投向天然綠色食品這一方向。因GABA具有降低血壓、解除抑郁、增強(qiáng)腦功能、強(qiáng)肝健腎等諸多藥理活性[1,6-11],關(guān)于GABA的保健功能、來源與提取等方面的研究引起國內(nèi)外高度重視,對GABA的開發(fā)利用成為新的研究熱點(diǎn)。在日本,特別是在成功開發(fā)出富含GABA的發(fā)芽糙米后,富含GABA的相關(guān)產(chǎn)品就被大力開發(fā),并且深受廣大消費(fèi)者青睞,現(xiàn)已形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),而且如今的GABA已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于飲品、食品、調(diào)味料、保健品、藥品等制品中,開發(fā)出適用于不同人群的食品,具有廣闊的市場前景。

面臨GABA的食品化,上述這些問題已經(jīng)引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注,隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,分離提取和檢測方法不斷豐富,但其制備工藝有待于進(jìn)一步向提取出安全食品級GABA方面完善,從更廣闊的大自然中攝取天然的GABA。拓展GABA的來源渠道,尋找高含量的物種,降低提取成本已成為有待解決的關(guān)鍵問題。隨著綠色時代的到來,大量的提取檢測方法將會繼續(xù)優(yōu)化,但GABA的檢測工作仍是科研工作者要攻克的技術(shù)問題。尋求快速準(zhǔn)確檢測GABA含量的方法會推動我國這一新資源的快速發(fā)展,同時也可以避免造假、低質(zhì)的產(chǎn)品流入市場,使市場規(guī)范化。高純度的GABA提取工藝技術(shù)還不夠成熟,且成本較高,不適合產(chǎn)業(yè)發(fā)展,食品級GABA提取技術(shù)在國內(nèi)仍有待完善。

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