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(1.湖北大學(xué)知行學(xué)院,生物工程系,湖北武漢 430010;2.昆明理工大學(xué)分析測試中心,云南昆明 650093;3.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東清遠(yuǎn) 511510)

板栗俗稱栗子,有“干果之王”的美稱[1]。栗殼為板栗的外果皮,藥性甘、澀、平,具有降逆、止血的功效,主治反胃、鼻衄、便血等癥[2]。正因為板栗的食用以及藥用價值,所以板栗各部分的研究引起了學(xué)者們的興趣。

大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn),從天然產(chǎn)物中分離出來的多糖往往是一種免疫調(diào)節(jié)劑,它能激活免疫細(xì)胞而對正常細(xì)胞沒有毒副作用。多糖作為免疫治療藥物正越來越受到重視,已成為新藥研究的熱點(diǎn)之一。越來越多的研究證明,多糖不但能治療導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷的癌癥,又能治療多種免疫缺損疾病,如慢性病毒性肝炎和某些耐藥細(xì)菌或病毒引起的慢性疾病[3-5],而且多糖作為藥物對細(xì)胞毒性小,在治療腫瘤時,它不像化療藥物直接殺死生長著的癌細(xì)胞,而是作為一種生物免疫反應(yīng)或加強(qiáng)抗體生成及激活劑補(bǔ)體等,以達(dá)到抑制和消滅腫瘤細(xì)胞的效果,對正常細(xì)胞影響極小[6]。多糖對多種惡性腫瘤、心血管疾病和抗衰老都有一定療效。近年來的研究表明糖結(jié)合物在信息傳遞、分子識別過程中具有關(guān)鍵作用[7]。

目前,國內(nèi)對于板栗多糖的研究還處在起步階段,相關(guān)報道不是很多,多集中在板栗多糖的提取工藝優(yōu)化、成分及活性研究[4,8-9]。很少有對于板栗殼中多糖的研究。本文以板栗殼為原料,利用超聲波輔助提取板栗殼中多糖物質(zhì),采用中心實驗設(shè)計優(yōu)化板栗殼多糖超聲輔助提取工藝參數(shù),為后續(xù)實驗和實際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗 湖北羅田;無水乙醚、過氧化氫、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、葡萄糖、蒽酮、乙酸乙酯、濃硫酸、丙酮 均為分析純。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9075A型 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)FW80型 天津市泰斯特儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2型 國華電器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ型 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY88-II型 寧波新芝生物科技股份有限公司;紫外-可見分光光度計WFJ-7200型 上海尤尼柯儀器有限公司;電子分析天平AR1140型 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 參考文獻(xiàn)[9-14]的方法。

研磨成粉→乙醚去脂→乙醇浸提→脫色→干燥

取新鮮羅田板栗,剝殼、干燥、磨粉(40目),按1∶3(m/v)的比例分別加入乙醚和乙醇進(jìn)行脫脂與除單糖和寡糖并用雙氧水脫色。精確稱取2g經(jīng)過上述處理的板栗殼粉2.0g于錐形瓶中,向錐形瓶加入蒸餾水放入超聲波儀器中,按設(shè)定條件(提取時間、超聲波功率、料液比)進(jìn)行超聲波提取,提取后的混合液用真空泵抽濾并移入分液漏斗中分離濾液,在濾液中加入三氯甲烷-正丁醇的混合液10mL,劇烈振蕩20min使其充分混勻,利用分液漏斗提取上清液,分離出三氯甲烷層,除去蛋白質(zhì)[13]。將上清液取5.0mL移入50mL容量瓶中定容,用于測定糖含量。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(200mg/L)0、2、4、6、8、10mL依次置于6個試管中,再分別加入去離子水至1.0mL[15],搖勻后分別加入新配制的0.2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.5mL和濃硫酸5.0mL搖勻[16],補(bǔ)齊至10mL后置于沸水中水浴10min,以空白溶液作參比,分別于620nm處測定吸光值(A)。以多糖質(zhì)量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度(A)對葡萄糖濃度(C)進(jìn)行回歸分析,并得回歸方程。

計算公式:多糖得率(%)=CX/M×100

式中:C為糖質(zhì)量濃度(mg/mL);X為稀釋倍數(shù);M為提取所用板栗殼粉的質(zhì)量(g)。

1.2.3 板栗殼多糖提取的單因素實驗 影響板栗殼多糖提取的因素有很多,本實驗分別考察超聲波功率、超聲波工作時間以及料液比三個因素進(jìn)行單因素實驗。具體做法如下[1,8,11]:

分別采取功率100、125、150、175、200W,在料液比1∶90、提取時間20min條件下提取板栗殼中的多糖,提取液于620nm處測定吸光值(A),考察超聲波功率對板栗殼多糖提取的影響;

分別采取超聲波處理時間10、15、20、25、30min,在料液比1∶90,功率150W條件下提取板栗殼多糖,提取液于620nm處測定吸光值(A)?？疾斐暡ㄌ幚頃r間對板栗殼多糖提取的影響;

分別采取料液比為1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110,在超聲波功率150W,超聲波工作時間為25min的條件下提取板栗殼多糖,提取液于620nm處測定吸光值(A)?？疾炝弦罕葘Π謇鯕ざ嗵堑寐实挠绊憽?/p>

1.2.4 板栗殼多糖提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化 分別以超聲波作用時間、功率和料液比3個因素為自變量,板栗殼多糖的得率為響應(yīng)值,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取單因素實驗中三個自變量的優(yōu)水平作為零水平,根據(jù)響應(yīng)面中心組合實驗設(shè)計原理設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化實驗。實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.2.5 驗證實驗 根據(jù)Design Expert軟件對響應(yīng)面優(yōu)化實驗的結(jié)果進(jìn)行分析,預(yù)測板栗殼多糖提取的最優(yōu)工藝組合。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)軟件分析給出的最優(yōu)工藝組合條件進(jìn)行驗證實驗以確定其可靠性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 單因素實驗使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行分析,響應(yīng)曲面實驗使用Design Expert軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及測定

以多糖質(zhì)量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。以吸光度(A)對葡萄糖濃度(C)進(jìn)行回歸分析,并得回歸方程。A=2.9991C,R2=0.9973。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲波功率對板栗殼多糖得率的影響 超聲波功率對板栗殼多糖得率影響如圖2所示。

由圖2可以看出,超聲波功率在100W到150W區(qū)間內(nèi),板栗殼多糖得率快速上升,在150W到175W內(nèi)的階段逐漸下降,在175W到200W內(nèi)平緩上升。當(dāng)超聲波功率為150W的時候,多糖得率最高,故最佳值取150W。

2.2.2 超聲波處理時間對板栗殼多糖得率的影響 超聲波處理時間對板栗殼多糖得率影響如圖3所示。

圖2 超聲波功率對多糖得率的影響 Fig.2 The effect of ultrasonic power on the rate of extraction of polysaccharide

圖3 超聲波處理時間對多糖得率的影響 Fig.3 The effect of time on the rate of extraction of polysaccharide

由圖3可以看出,當(dāng)超聲波作用時間在10～20min時,多糖得率呈現(xiàn)明顯上升趨勢,而后趨于平緩。當(dāng)作用時間超過25min后基本變化不大。因此,當(dāng)超聲波作用時間超過25min能得到較高的吸光度值,考慮到成本和設(shè)備使用情況,因此取25min為最佳值。

2.2.3 料液比對板栗殼多糖得率的影響 實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對多糖得率的影響 Fig.4 The effect of material-liquid ratio on the rate of extraction of polysaccharide

由圖4可以看出,當(dāng)料液比小于1∶70時多糖的得率是逐漸增大的,而當(dāng)料液比大于1∶90之后,其多糖的提取率呈降低趨勢,根據(jù)圖4所反映的情況本次實驗以1∶70為最佳值用于后續(xù)響應(yīng)面分析。

2.3 響應(yīng)面實驗

2.3.1 響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定響應(yīng)面曲面實驗中的超聲波功率(A)、作用時間(B)、料液比(C)三個因素,根據(jù)Central composite中心組合實驗原理,進(jìn)行響應(yīng)面分析實驗。實驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果Table 2 Factors and levels in the response surface central composite design arrangement and corresponding experimental results

經(jīng)過Design Expert軟件對板栗殼多糖的得率與不同操作參數(shù)之間建立多種擬合模型,通過多種擬合模型比較發(fā)現(xiàn)二次方程模型的擬合效果較其他模型好。以板栗殼多糖得率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸,建立二次回歸模型,得到板栗殼多糖得率預(yù)測值對編碼自變量A、B、C的二次多項回歸方程:

Y=11.41+0.18A+0.13B-0.29C+0.18AB+0.20AC-0.05BC-0.8A2-1.06B2-1.24C2

為了檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?對模型進(jìn)行方差分析。由表3可知,模型是顯著,回歸模型的p<0.01(極顯著),說明該模型能夠很好地描述實驗結(jié)果。因此,可用此模型對板栗殼多糖提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測。同時從表3的數(shù)據(jù)分析可以看出A、B、C一次項均不顯著。二次項A2、B2、C2為實驗極顯著影響因素。交互項AB、AC、BC不顯著。說明在此模型當(dāng)中,A、B、C因素的一階以及交互作用并不顯著。在三個因素之間相比較而言,料液比對板栗殼多糖提取效果影響最大,其次是超聲波功率,處理時間對板栗殼多糖提取效果影響相對較小。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression model

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 超聲波提取功率與處理時間的交互作用響應(yīng)曲面見圖5。由圖5可看出,在料液比為1∶70的條件下,超聲波提取功率與作用時間的交互作用不顯著(p=0.4511>0.05)。隨著超聲波提取功率和作用時間的增大,響應(yīng)面的響應(yīng)值是平緩的先上升后下降,說明響應(yīng)值對于超聲波提取功率的改變不敏感。

圖5 超聲波功率與作用時間交互作用的響應(yīng)曲面 Fig.5 The interactive response surface plots between ultrasonic power and time

超聲波提取功率與料液比交互作用的響應(yīng)曲面見圖6。由圖6可以看出,在作用時間為25min時,超聲波提取功率與料液比交互作用不顯著(p=0.4155>0.05)。隨著超聲波提取功率的增大,響應(yīng)面的響應(yīng)值平緩的先升高后降低;隨著料液比的增大響應(yīng)面的響應(yīng)值先上升后下降。

圖6 超聲波提取功率與料液比交互作用響應(yīng)曲面 Fig.6 The interactive response surface plots between ultrasonic power and liquid ratio

作用時間與料液比交互作用響應(yīng)面見圖7。由圖7可以看出,在超聲波提取功率為150W時,作用時間與料液比對響應(yīng)值的交互作用不顯著(p=0.8320>0.05)。隨著料液比的增加,響應(yīng)面的響應(yīng)值先升高后降低;隨著的作用時間的增長,響應(yīng)面的響應(yīng)值先升高后緩慢的下降。

圖7 作用時間與料液比交互作用響應(yīng)面 Fig.7 The interactive response surface plots between time and liquid ratio

2.3.3 最佳工藝條件確定及驗證 通過軟件分析得響應(yīng)面法優(yōu)化板栗殼多糖提取的最佳工藝條件:超聲波提取功率為165W,作用時間26.875min(取27min),料液比為1∶62.3(取1∶62)。按照選擇的最佳工藝進(jìn)行實驗來驗證是否符合模型方程式預(yù)測的最佳響應(yīng)值,實驗測得多糖得率為11.48%,與預(yù)測值11.4358%較接近,說明優(yōu)化的得到的最佳工藝條件與實際情況擬合好,驗證了建立的模型的正確性。

3 結(jié)論

本文以板栗殼為研究對象,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)曲面設(shè)計法優(yōu)化進(jìn)行工藝優(yōu)化,得出超聲波提取板栗殼多糖工藝條件:超聲波功率為165W,處理時間為27min,料液比為1∶62。優(yōu)化后超聲波提取板栗殼多糖的得率為11.48%。這三個因素對于板栗殼多糖提取工藝影響的順序為:料液比>超聲波功率>處理時間。經(jīng)驗證實驗證明優(yōu)化效果較好,證明該數(shù)學(xué)模型是合理可靠的,對板栗殼多糖的提取工藝可行。

[1]谷絨. 超聲波和微波法對木耳多糖提取量的比較[J]. 食品研究與開發(fā),2010,31(3):23-25.

[2]羅鳳蓮.板栗淀粉的理化特性與板栗產(chǎn)品開發(fā)研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[3]謝明勇,聶少平. 天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報,2010,10(2):1-11.

[4]陳和生,孫振亞,李漢東,等. 羅田板栗多糖的分離純化及成分分析[J]. 中國藥學(xué)雜志,2002,37(1):63-64.

[5]熊俐,黃治國,羅惠波,等. 枸杞多糖提取工藝優(yōu)化研究[J].四川食品與發(fā)酵,2008,44(1):649-652.

[6]Shaoping Nie,Mingyong Xie,Peng Zhou,etal.Invitroantioxidative and anticancer activities of tea glycoprotein in green tea[J]. European Food Research and Technology,2007(4):437-442.

[7]J P F Angeli,L R Ribeiro,M L C Gonzaga,etal. Protective effects of β-glucan extracted from Agaricus brasiliensis against chemically induced DNA damage in human lymphocytes[J]. Cell Biology and Toxicology,2006(4):285-291.

[8]何玲玲,王新,劉彬,等. 板栗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械,2010,26(2):72-75.

[9]楊芳,曹銀,廖緒彪,等. 板栗多糖的超聲波輔助提取技術(shù)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,12(4):22-25.

[10]施翠娥,蔣立科,李苗苗. 大豆多糖提取分離工藝的優(yōu)化研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報,2009,15(3):148-150.

[11]褚立軍,但飛君,鄢文芳,等. 超聲波提取白根獨(dú)活多糖工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(12):6216-6217,6230.

[12]劉齊,劉愛紅,孫美玲,等. 嗜酸乳桿菌胞外多糖提取工藝優(yōu)化[J]. 食品發(fā)酵工業(yè),2011,37(2):200-204.

[13]高宛莉,王麗,杜瑞卿. 仙人掌多糖提取工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)技服務(wù),2009,26(11):133-134.

[14]王浩然,魏福祥,馬曉珍,等.板栗殼棕色素提取方法的比較研究[J]. 河北工業(yè)科技,2010,(6):458-461.

[15]王 磊,邱芳萍,王志兵. 糞鬼傘多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成的研究[J]. 中國食用菌,2008,27(5):38-40.

[16]Nakamura A,Takahashi T,Yoshida R,etal.Emulsifying properties of soybean soluble polysaeeharide[J].Food Hydroealloids,2004,18:795-803.