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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.北大荒豆制品有限公司,黑龍江哈爾濱 150060)

透析、超濾、納濾為目前主要的脫鹽方法,但這些方法對(duì)小分子脫鹽效果不佳,而且肽回收率較低[5]。已有報(bào)道關(guān)于大孔樹脂對(duì)魚降壓肽有很好的脫鹽效果[6]。潘道東等研究了DA201-C對(duì)ACE抑制肽的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)[7]。大孔樹脂利用的是吸附原理和分子篩原理,它主要通過范德華力、氫鍵的分子間作用力對(duì)分子進(jìn)行吸附。在合適的環(huán)境下,吸附劑的內(nèi)表面積愈大,吸附量愈高。鄧勁光,程云輝分別研究了不同種類的大孔樹脂對(duì)氫化可的松,麥胚肽的吸附洗脫性能[8-9]。基于樹脂孔徑的大小、極性的強(qiáng)弱和已有的研究綜合考慮,選擇5種不同樹脂對(duì)大豆肽進(jìn)行靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn),在確定吸附性能較好樹脂基礎(chǔ)上,優(yōu)化出樹脂的最佳脫鹽條件,并對(duì)大豆肽進(jìn)行初步的分離和純化。

表1 大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Physics configuration parameters of the macroporous resin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DA201-C、AB-8、D3520、D4006和NAX-Ⅱ大孔吸附樹脂 鄭州勤實(shí)科技有限公司;大豆分離蛋白(蛋白含量89.12%) 谷神生物科技集團(tuán)有限公司;Alcalase堿性蛋白酶諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;Folin-酚試劑 美國Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;LGJ 21真空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;pH計(jì) 奧多利斯科學(xué)(北京)有限公司;UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì) 島津公司;1.5×60cm的層析柱 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;HZQ-X100震蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白酶解液的制備 稱取一定質(zhì)量的大豆分離蛋白于酶反應(yīng)器中,加水調(diào)成一定的底物濃度(蛋白/水,w/w),磁力攪拌器勻速攪拌,待原料充分溶解后,反應(yīng)溫度為55℃,pH控制在(8.0±0.10)。加入一定量的堿性蛋白酶,酶解時(shí)間為2h。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí),pH調(diào)為4.5使未水解的大分子蛋白沉淀,90℃滅酶10min,6000r/min離心10min,即得到粗酶解液,濃縮,冷凍干燥得到大豆肽。用pH-State法[10]控制酶解液的水解度,此水解度為15.6%。

1.2.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 本實(shí)驗(yàn)選用5種大孔吸附樹脂,樹脂的具體參考性能見表1。大孔吸附樹脂首先用無水乙醇浸泡24h,使樹脂充分溶脹,然后洗至220nm處無吸收峰,再用去離子水洗凈至無乙醇味,抽濾備用[11]。

1.2.2.2 大孔樹脂條件的優(yōu)化 于250mL錐形瓶中加入經(jīng)過預(yù)處理后的2.5g不同種類的樹脂,分別向其中濃度為25mg/mL的酶解液50mL,在搖床上震蕩12h,使其充分吸附,用不同稀釋度25%、50%、75%、100%的乙醇溶液對(duì)樹脂進(jìn)行靜態(tài)解析,并測(cè)定溶液中肽的濃度及測(cè)定其脫鹽效果。脫鹽效果的測(cè)定用的是鉻酸鉀指示劑法測(cè)定肽液中Cl-濃度[12]。

1.2.2.3 DA201-C樹脂靜態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

a.pH對(duì)DA201-C樹脂吸附性能的影響:向5個(gè)250mL的錐形瓶中加入預(yù)處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。取5份濃度為15mg/mL的酶解液30mL,將pH分別調(diào)為4、5、6、7、8加入到錐形瓶中,置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。吸附后多肽含量用Foline-酚法測(cè)定[13]。

b.酶解物濃度對(duì)DA201-C樹脂吸附性能的影響:向3個(gè)錐形瓶中加入預(yù)處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。向其中分別加入濃度為15、30、45、60mg/mL的酶解液20mL(pH均為4.5)。置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。多肽含量測(cè)定方法如上。

c.不同乙醇濃度對(duì)解吸特性的影響:向5個(gè)錐形瓶中加入預(yù)處理好的2.5g的樹脂,乙醇充分溶脹之后,用去離子水洗凈乙醇,抽濾后備用。加入底物濃度為60mg/mL酶解液20mL,pH4.5,置于25℃恒溫震蕩箱中,震蕩12h。向其中分別加入濃度為0、25%、50%、75%和100%的無水乙醇溶液進(jìn)行解吸。多肽含量測(cè)定方法如上。

解析率(%)=解析液多肽濃度×解析液體積/吸附量×樹脂質(zhì)量×100

d.DA201-C樹脂對(duì)酶解液的動(dòng)態(tài)解析特性研究:把預(yù)處理好的大孔吸附樹脂裝滿1.5cm×60cm的層析柱,室溫條件下,以1.5mL/min流速的酶解液經(jīng)過層析柱,酶解液濃度為60mg/mL。用紫外檢測(cè)器于220nm處測(cè)定吸光值,以A220nm=0.05為透過點(diǎn),先用去離子水以同樣的流速流經(jīng)層析柱,每5min收集一管水洗脫液,當(dāng)水洗脫液于去離子水的電導(dǎo)率相當(dāng)時(shí),用75%的乙醇對(duì)DA201-C樹脂以同樣的流速進(jìn)行洗脫,每5min收集一管水洗脫液,并不斷用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。測(cè)定脫鹽率及肽回收率。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種不同大孔樹脂的初步篩選

由圖1,可以得出所對(duì)應(yīng)的5種大孔樹脂的吸附率分別為25.4%、32.33%、50.7%、35.97%、28.93%。經(jīng)F檢驗(yàn)p<0.05,各樹脂間吸附率存在差異,接著進(jìn)行了多重比較,得出各樹脂之間差異顯著,其中DA201-C的吸附率較其它樹脂好,原因可能是該樹脂屬于非極性樹脂,比表面積較大,當(dāng)濃度一定時(shí),比表面積越大,單位時(shí)間內(nèi)吸附蛋白的量越大。堿性蛋白酶酶解物具有較多的疏水性氨基酸,疏水基團(tuán)與非極性吸附劑間形成范德華力、氫鍵[14],起到了很好的吸附效果。

圖1 5種大孔樹脂的吸附率 Fig. 1 Adsorption rate of five macroporous resins

由圖2結(jié)果可見當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí),該列字母不同者為差異性顯著。DA201-C樹脂解析效果最好,且顯著高于其他各組(p<0.05)。由于不同濃度的乙醇具有不同的極性,其吸附解析過程對(duì)蛋白具有不同的選擇性。其實(shí)質(zhì)是一種疏水性質(zhì)的置換過程,乙醇能消弱蛋白質(zhì)非極性側(cè)鏈的排水傾向,從而使肽洗脫下來[15]。當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí),酶解物的解吸率下降可能是由于相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽類在無水乙醇中溶解度較低導(dǎo)致的。

圖2 5種大孔樹脂的靜態(tài)解析曲線 Fig. 2 Static adsorption curves of five macroporous resins to soybean peptides

不同樹脂脫鹽率見圖3,由圖可知,5種樹脂平均值均在85%以上,其中DA201-C的脫鹽率為92.9%,各樹脂間脫鹽率差異不顯著(p>0.05),均具有較好的脫鹽率,說明大孔樹脂對(duì)于鹽溶液不具有吸附性,在活性肽脫鹽方面起到很好的效果。

圖3 不同樹脂的脫鹽率 Fig. 3 Desalination rates of different macroporous resins

根據(jù)不同樹脂的靜態(tài)吸附得出DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)大豆肽具有較好的吸附和解析性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)DA201-C大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附解析特性進(jìn)行研究,并測(cè)其動(dòng)態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)。

2.2 DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)大豆肽的靜態(tài)吸附與解析

2.2.1 pH對(duì)DA201-C吸附性能的影響 由圖4看出,pH在4～6之間吸附量之間不存在顯著差異,在酶解過程中需要把pH調(diào)為4.5沉淀大分子,直接用酶解液進(jìn)行脫鹽處理即可。此結(jié)論與張曉梅[16]在大豆活性肽的研究中報(bào)道相一致。當(dāng)pH為8.0時(shí),吸附量有所增加,可能是酶解物為兩性的多肽混合物,其離子化程度的不同而使其發(fā)生變化。

圖4 不同pH條件下的吸附量 Fig. 4 Effect of different pH on adsorption capacity

2.2.2 不同酶解物濃度對(duì)吸附性能的影響 由圖5我們可以看出,隨著底物濃度的增加,大孔樹脂對(duì)大豆肽的吸附量增加,大豆肽的底物濃度為60mg/mL時(shí),樹脂具有很好的吸附特性。在樹脂吸附的同時(shí)也伴隨著肽含量的損失,為了減少肽含量的損失,綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選則濃度為60mg/mL的大豆肽進(jìn)行吸附解析。

圖5 不同大豆肽濃度的吸附量 Fig.5 Effect of diffent soybean peptide concentrations on adsorption capacity

2.2.3 優(yōu)化條件下的吸附解析特性 在最優(yōu)條件(pH4.5、底物濃度為60mg/mL)下,大孔樹脂對(duì)酶解大豆肽的吸附解吸特性見圖6。由圖6可知,在吸附量較為接近的情況下,乙醇濃度為75%時(shí),具有較好的解析率,解析率為85.5%。 通過條件的優(yōu)化使得DA201-C大孔樹脂的吸附率有所增加,減少了多肽含量的損失,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

圖6 優(yōu)化條件下的吸附解吸情況 Fig.6 Effect of adsorption and desorption on the optimum condition

2.3 DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)酶解液的動(dòng)態(tài)解析特性的影響

由圖7看出,75%的乙醇在3h內(nèi)能將大部分肽洗脫下來,在洗脫1h左右出現(xiàn)洗脫峰,在洗脫1.5～2h時(shí)洗脫曲線逐漸趨于平緩,肽的洗脫速率緩慢下降,可能由于一些相對(duì)分子質(zhì)量較大的組分在75%的乙醇中溶解度較低不易被洗脫下來的緣故。洗脫下來的組分脫鹽率達(dá)到93.23%,肽回收率為88.5%。

圖7 DA201-C大孔吸附樹脂 對(duì)大豆肽的動(dòng)態(tài)解析特性曲線 Fig.7 Dynamic desorption curve of soybean peptides from DA201-C macroporous resins

3 結(jié)論

DA201-C、AB-8、D3520、D4006、NAX-Ⅱ5種大孔吸附樹脂初步篩選,得出DA201-C大孔樹脂吸附解吸效果最好,并確定其最佳條件為pH4.5,底物濃度為60mg/mL,洗脫劑為75%的乙醇,脫鹽率和肽回收率都較高。大孔吸附樹脂脫鹽可以作為一種行之有效的方法,其操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、易于再生、減少生產(chǎn)成本,并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了初步的分離,為進(jìn)一步的分離純化和生物功能的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

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