，，，，

(中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所,北京 100091)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)系山茶科山茶屬植物,是我國特有的重要食用油料作物。油茶餅粕是油茶果榨取茶油過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物,我國油茶餅粕的年產(chǎn)量約為40萬t[1]。由于油茶餅粕中單寧、茶皂素等溶血性物質(zhì)含量較高,不適宜直接用于生產(chǎn)動物飼料,目前利用率不高,絕大部分基本上被廢棄[2]。有關(guān)文獻(xiàn)報道,油茶餅粕是一種營養(yǎng)價值較高的榨油工業(yè)副產(chǎn)品,含有豐富的蛋白質(zhì)、單寧、茶皂素以及糖類化合物等有用成分,其中蛋白質(zhì)含量最高,約為15%～18%[3-4],可作為蛋白飲料、沖調(diào)食品、焙烤食品的蛋白強(qiáng)化劑等的蛋白質(zhì)原料,具有較高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值[5-9]。因而,對油茶餅粕蛋白的提取及科學(xué)有效利用,不僅可以抑制油茶餅粕資源的浪費(fèi),使油茶餅粕由“廢”變“寶”,也為人們獲取大量豐富的植物蛋白提供了一條新途徑。

目前關(guān)于油茶餅粕蛋白提取的研究很少,少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報道主要是采用“堿提酸沉淀”方法獲得蛋白質(zhì),并通過正交實(shí)驗確定最佳提取條件,而傳統(tǒng)的正交實(shí)驗無法獲得影響因素與響應(yīng)值之間明確的函數(shù)關(guān)系,從而無法獲得各因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值[1,8-10]。另外,超聲波輔助法作為一種新興的提取方法,可實(shí)現(xiàn)各種動、植物有效含量的高效提取,雖然在油脂、多糖、香味等物質(zhì)的提取中已有較廣泛的運(yùn)用,但在油茶餅粕蛋白提取應(yīng)用方面還未見報道?；谀壳坝嘘P(guān)油茶餅粕蛋白提取方面研究的不足,本論文采用超聲波輔助復(fù)合溶劑法提取油茶餅粕中的蛋白,運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化蛋白的提取工藝條件,建立提取工藝與油茶餅粕蛋白提取率之間的數(shù)學(xué)模型,并獲得最優(yōu)的蛋白提取工藝參數(shù),以期為油茶餅粕蛋白的高效提取和進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 油茶果榨取山茶油后產(chǎn)生的副產(chǎn)物,140～160目,呈棕褐色,含水率為6%～8%,由中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所提供;氫氧化鈉、無水碳酸鈉、碘化鉀、鹽酸、鹽酸羥胺甲醇、甲基紅 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PHS-3B型多功能酸度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JJ-1型精密增力電動攪拌器 金壇科析儀器有限公司;NH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇榮華儀器制造有限公司;DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;CENTRIFUGE MODEL 2-40A型離心機(jī) In Top Biolab.,Inc;FTS systems冷凍干燥機(jī) 德國Stone RIDGE公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 油茶餅粕基本成分測定 水分含量測定,采用《糧食、油料檢驗水分測定法》(GB 5505-85);灰分含量測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5505-85);粗脂肪含量的測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5512-85);粗纖維含量的測定,采用《糧食、油料檢驗灰分測定法》(GB 5515-85);總糖量含量的測定,采用亞鐵氰化鉀滴定法[11];茶皂素、單寧的含量測定,根據(jù)已有文獻(xiàn)報道的方法[12-13];粗蛋白含量的測定,離心沉淀用凱氏定氮法,上層清液蛋白含量用Folin-酚法測定,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2 油茶餅粕蛋白提取方法 油茶餅粕經(jīng)干燥、粉碎后過140～160目篩子,用索氏提取裝置加石油醚除去油脂,低溫烘干。取100g脫脂的油茶餅粕粉加入4000mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液,調(diào)節(jié)溶液的pH8～11,在30～60℃的水浴中進(jìn)行超聲波提取,一段時間后過濾得濾液;將過濾殘渣再按“100g殘渣:4000mL乙醇水溶液”的比例進(jìn)行二次、三次浸提。合并濾液并靜置過夜,然后再進(jìn)行過濾,將濾液的上清液在4000r/min的速度下離心10min,用20%的HCl將離心后得到的上清液的pH調(diào)至4.2(蛋白等電點(diǎn)),待沉淀出現(xiàn)、穩(wěn)定后,將沉淀物低溫冷凍干燥,最終得到油茶餅粕蛋白。

蛋白提取率(%)=(提取蛋白的質(zhì)量/原料中含有的蛋白質(zhì)量)×100

油茶餅粕蛋白提取的工藝流程如圖1。

圖1 油茶餅粕中植物蛋白的提取工藝流程 Fig.1 Technical process of protein extraction of oil-tea cake

1.2.3 響應(yīng)曲面油茶餅粕蛋白提取實(shí)驗設(shè)計

1.2.3.1 提取工藝參數(shù)的確定 影響蛋白提取的因素主要有料液比(原料與提取溶劑的比)、提取時間、提取溫度、超聲波功率、提取介質(zhì)的pH。一般提取時間越長,提取溫度越高,蛋白的提取率就越高。不過,當(dāng)提取時間達(dá)到一定時長,蛋白提取率增加的幅度很小,甚至無明顯變化;而溫度提高到一定程度后,不但不會使蛋白的提取率增加,反而會造成蛋白提取率的下降,這是因為溫度過高致使蛋白變性析出,在過濾時將其濾出,故使得到蛋白的質(zhì)量減少,提取率降低。伍曉春等對影響油茶餅粕蛋白提取率的提取時間、提取介質(zhì)pH、料液比、提取溫度等工藝參數(shù)進(jìn)行了研究探討[8]。實(shí)驗結(jié)果表明,在這四個影響因素中,對蛋白提取率影響的主次順序是pH、料液比、提取時間、提取溫度,并得出了這些工藝參數(shù)較合理的取值范圍:pH為9～11、提取時間為30～90min、提取溫度為35～60℃、料液比為1∶30～1∶50(優(yōu)選為1∶40)[8]。目前,有關(guān)超聲波對油茶餅粕蛋白提取率的影響研究未見文獻(xiàn)報道,有少量報道是關(guān)于超聲波輔助其他植物蛋白提取的研究,一般將超聲波的功率選擇在150～450W。

1.2.3.2 提取工藝實(shí)驗設(shè)計方案 根據(jù)提取時間、提取介質(zhì)pH、料液比、提取溫度、超聲功率等工藝條件對油茶餅粕蛋白提取率影響的主次因素以及對應(yīng)工藝參數(shù)的合理取值范圍,本實(shí)驗選用提取溫度、提取時間、超聲波功率和介質(zhì)pH作為影響油餅粕蛋白提取率的考察因素,以+1、0、-1分別代表高、中、低水平,料液比選為1∶40,各實(shí)驗因素水平與編碼見表1。采用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(CCRD)原理,以油茶餅粕蛋白提取率為響應(yīng)值,利用Design Expert 7.0.0軟件設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)曲面分析實(shí)驗,共31個實(shí)驗點(diǎn),其中24個析因點(diǎn),7個零點(diǎn),通過零點(diǎn)實(shí)驗估計誤差,并對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析,建立二次多項式數(shù)學(xué)模型,求解出油茶餅粕蛋白提取率最大值。

表1 實(shí)驗因素水平和編碼Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 油茶餅粕蛋白提取工藝的驗證 為了驗證通過響應(yīng)曲面優(yōu)化得出的最佳提取工藝條件及其預(yù)測提取率的準(zhǔn)確性和有效性,在最佳工藝下進(jìn)行3次驗證實(shí)驗,并將平均值作為最終的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶餅粕基本成分分析

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實(shí)驗方法,對油茶餅粕的基本組成成分進(jìn)行定量檢測。如表2所示,油茶餅粕中主要含有16.8%粗蛋白,35.4%總糖量,13.5%粗纖維,11.7%茶皂素,8.3%單寧，3.4%粗脂肪，8.2%水分以及2.7%其它成分,其中粗蛋白含量較高,僅次于總糖量,完全有價值進(jìn)行蛋白提取,其營養(yǎng)價值有待開發(fā)。另外,油茶餅粕中還含有茶皂素和單寧兩大抗?fàn)I養(yǎng)成分,這正是油茶餅粕不能直接利用作為動物飼料的主要原因。

表2 油茶餅粕基本成分的組成及其含量Table 2 Components of oil-tea cake

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)曲面結(jié)果的方差分析 響應(yīng)曲面法實(shí)驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,其方差分析結(jié)果見表4。由表4中的方差分析可知,X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42對油茶餅粕蛋白提取率的影響極其顯著,說明提取時間、提取溫度、介質(zhì)pH、超聲功率是油茶餅粕蛋白提取過程中的重要控制因素,而它們之間的交互效應(yīng)不顯著。從表4中F值的大小可以看出,在提取時間、提取溫度、超聲功率、介質(zhì)pH四個因素中,對油茶餅粕蛋白提取率的影響的主次順序依次是介質(zhì)pH、超聲功率、提取時間、提取溫度。失擬項的p值為0.1946,沒有顯著性意義,說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn),數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表3 響應(yīng)曲面實(shí)驗方案與結(jié)果Table 3 Response surface results of extraction process of oil-tea cake protein

2.2.2 油茶餅粕蛋白提取工藝的回歸模型方程建立 運(yùn)用SPSS軟件對表3和表4中的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,建立以X1、X2、X3、X4為自變量,油茶餅粕蛋白提取率為響應(yīng)值的二次多項回歸方程:

Y=69.84+3.08X1+2.18X2+4.93X3+5.21X4-0.61X1X2+0.31X1X3-0.08X1X4-0.22X2X3+0.32X2X4-0.02X3X4-5.61X12-4.96X22-6.22X32-7.85X42

其中Y為油茶餅粕蛋白的提取率,X1、X2、X3和X4分別為提取時間、提取溫度、超聲功率和介質(zhì)pH的編碼值。

為了驗證二次回歸模型的可信性,分別對模型的決定系數(shù)、校正決定系數(shù)、變異系數(shù)等特征參數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。

表5 回歸模型的可信度分析Table 5 Fit statistics of regression equation

由表5可以看出,回歸方程的F值為32.7307,大于F值的概率(Pr>F)為<0.0001,說明回歸方程本身對蛋白提取率的影響是顯著的。失擬項反映的是實(shí)驗數(shù)據(jù)與模型不相符的情況,本方程的失擬項p不顯著(見表4),表明方程對實(shí)驗擬合性良好,實(shí)驗誤差小。由模型可信度分析表可知,回歸方程的決定系數(shù)R=0.9663,說明模型方程可以解釋96.63%的實(shí)驗所得油茶餅粕蛋白提取率的變化,表明方程擬合性好。決定系數(shù)和校正決定系數(shù)相近,信噪比大于4,這均說明擬合方程可靠,準(zhǔn)確。變異系數(shù)(CV)表示實(shí)驗的精確度,CV值越高,實(shí)驗的可靠性越低[2]。本實(shí)驗設(shè)計中CV為6.5228%,說明實(shí)驗有較好的精確度和可靠性,可以用該回歸方程代替真實(shí)實(shí)驗點(diǎn)對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.3 最佳提取工藝的確定及驗證 利用2.2.2節(jié)中獲得回歸方程,分別對X1、X2、X3、X4進(jìn)行求偏導(dǎo),在實(shí)驗范圍內(nèi)尋求出油茶餅粕蛋白的最大提取點(diǎn)及最佳工藝條件,即提取時間為68min、提取溫度為48℃、介質(zhì)pH為10、超聲功率350W,模型預(yù)測的提取率為72.4%。

表4 響應(yīng)曲面結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of response surface results

為了驗證回歸方程模型的可靠性,在最佳優(yōu)化提取條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗,實(shí)驗結(jié)果顯示,三次實(shí)驗提取率分別為71.8%、72.0%、72.1%,平均提取率為71.97%,與模型預(yù)測的理論值的誤差僅為0.6%,說明該回歸方程能真實(shí)地反映各篩選因素對油茶餅粕蛋白提取率的影響,證明用響應(yīng)曲面法尋求最佳蛋白提取工藝是較為可靠的。與通過正交方法優(yōu)化蛋白提取工藝相比,采用超聲波輔助法提取油茶餅粕中蛋白可顯著提高油茶餅粕蛋白的提取量,說明本超聲波輔助提取油茶餅粕蛋白是一種高效的植物蛋白提取方法。

3 結(jié)論

本研究通過測定油茶餅粕的基本組成成分,明確了餅粕中含有可觀的植物蛋白,其營養(yǎng)價值有待開發(fā)。采用響應(yīng)曲面法對超聲波輔助復(fù)合溶劑提取油茶餅粕蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,通過建立油茶餅粕蛋白提取率(Y)與提取時間、提取溫度、介質(zhì)pH和超聲功率之間的二次多元回歸模型,求解出最優(yōu)油茶餅粕蛋白提取工藝條件為:提取時間68min、提取溫度48℃、介質(zhì)pH10、超聲功率350W,模型預(yù)測提取率為72.4%。在該工藝條件下通過三次平行實(shí)驗獲得的平均提取率為71.97%,與模型預(yù)測的理論值的誤差僅為0.6%,說明該回歸方程是合理可靠的,能較好地預(yù)測油茶餅粕蛋白的提取率,具有實(shí)用價值。

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