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(1.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的植物次生代謝物質,近年來,因其具有抑制心血管疾病、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤以及抗輻射等活性而備受關注[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)松科植物體內含有大量的具有一系列獨特的生物活性的多酚類化合物,這類物質統(tǒng)稱為松多酚。松多酚的獨特結構賦予了它一系列獨特的化學性質,不僅使其成為一種色素類天然抗氧化劑[2],還使其具有抗腫瘤[3]、防治冠心病與中風等心腦血管疾病[4]、抗動脈硬化、降血脂降血糖[5-6]以及抗菌等多種生理功能。但由于松多酚難以實現(xiàn)大批量、高純度的工業(yè)化生產,因此使其雖具有廣闊的市場前景但不易實現(xiàn)市場化。

大孔樹脂作為一類不溶于酸、堿和各種有機溶劑,具有較好吸附性的有機高分子聚合物,具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附量大、選擇性好、吸附解析速度快、易于再生等優(yōu)點[7-8],近年來被廣泛用于多酚類以及黃酮類物質分離與富集[9-10]。目前,以大孔吸附樹脂為固相介質的色譜分離純化技術在植物功能性化學成分的分離、純化以及富集中的應用日趨廣泛[11-12]。

本研究對不同的樹脂進行多酚靜態(tài)吸附解析實驗,選出最優(yōu)樹脂進行柱層析,建立樟子松樹皮多酚二級純化方法;并用HPLC-DAD-ESI-MS分析方法對純化后的多酚成分進行了初步分析,為樟子松樹皮多酚的開發(fā)利用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟子松(PinussylvestrisL.)樹皮收集于黑龍江哈爾濱,收集時間為2012年10月份,自然烘干至恒重后粉碎過40目篩,備用。

甲醇(色譜純) 天津科密歐化學試劑有限公司;娃哈哈純凈水;大孔樹脂D101、X-5、D3520、ADS-7、S-8、ADS-17、NKA-9、NKA-2、AB-8 天津海光試劑公司;其它所用化學試劑均為國產分析純。

三孔電熱恒溫水槽DK-8D型 上海一恒科學有限公司;電子天平JA2003型 上海良平儀器儀表有限公司;可見分光光度計722型 上海光譜儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ型 鄭州長城科工貿有限公司;中藥粉碎機FW135型 天津市泰斯特儀器有限公司;玻璃層析柱(2.5cm×70cm) 上海滬西分析儀器廠。安捷倫1200-6520高精度四級桿-飛行時間液質聯(lián)用儀 美國安捷倫公司,配有四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、紫外檢測器和Chemstation數據工作站;Sino Chrom ODS-BP 反向色譜柱(5μm、4.6mm×150mm) 大連依利特。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的制備 參考文獻[13]，稱取一定質量的樟子松樹皮粉末,以體積分數50%的乙醇作為溶劑,按料液比1∶25進行水浴浸提,水浴溫度為50℃,浸提時間4h,將浸提液在4000r/min的條件下離心分離15min后減壓濃縮蒸去乙醇,得到多酚粗提物;將上述粗提物在上樣濃度3mg/mL,上樣體積30mL,洗脫劑乙醇濃度為53%條件下進行一次純化,控制上樣流速5BV/h,洗脫流速4.25BV/h;收集純化物,減壓濃縮蒸去乙醇,得到樟子松樹皮多酚一級純化產物。

1.2.2 Folin-Ciocalteu法測定多酚

1.2.2.1 標準曲線的繪制 參考文獻[14]，精確稱取(0.100±0.01)g沒食子酸溶解并定容于100mL容量瓶中,配制成1000μg/mL的標準儲備溶液;用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL的沒食子酸標準儲備溶液于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成濃度分別為10、20、30、40、50、60、70μg/mL的工作溶液。分別移取不同濃度的工作液各1mL于10mL棕色容量瓶中,分別加入5.0mL 10%福林酚試劑,搖勻,反應5min后加入4.0mL 7.5%的Na2CO3溶液并定容;置于25℃恒溫水浴中反應1h,以蒸餾水作空白對照于765mm波長下測定吸光值。以沒食子酸的質量濃度為橫坐標,765nm波長下吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣品的測定 精確移取1mL樣品溶液于10mL棕色容量瓶中,加入5.0mL 10%福林酚試劑,搖勻,反應5min后加入4.0mL 7.5%的Na2CO3溶液并定容;置于25℃恒溫水浴中反應1h,以蒸餾水作空白對照于765mm波長下測定吸光值。根據標準曲線計算樣品含量。

1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附解析篩選

1.2.3.1 大孔樹脂預處理 將9種不同的大孔吸附樹脂分別用無水乙醇浸泡24h后用蒸餾水沖洗至無醇味,再用質量分數4%的NaOH溶液浸泡24h,蒸餾水沖洗至中性后,用體積分數10%的HCl溶液浸泡24h,蒸餾水沖洗至中性備用。不同大孔樹脂基本理化性質如表1所示。

表1 9種大孔樹脂理化性質Table 1 The physical and chemical properties of macroporous resins

1.2.3.2 樹脂的靜態(tài)吸附解析 根據李波等實驗方法并加以改進[15]:分別取自然干燥的樹脂每種5份,每份各2.0g于100mL錐形瓶中,加入50mL 2mg/mL的一級純化液并于室溫條件下恒溫振蕩器振蕩吸附12h,吸取上清液測定多酚含量,并計算吸附率;將吸附后的樹脂過濾,用蒸餾水沖洗后濾干,置于100mL錐形瓶中,向每種樹脂的5份試樣中分別加入體積分數40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50mL恒溫振蕩解析12h,吸取解析液測定多酚含量,計算解析率。比較不同大孔樹脂的吸附率以及不同乙醇濃度下的解析率,確定柱層析最優(yōu)樹脂以及解析劑乙醇的濃度。

吸附率公式:E1(%)=(C0-C1)/C0×100

解析率公式:E2(%)=C2×V2/(C0-C1)V1×100

式中,E1-吸附率(%);E2-解析率(%);C0-起始多酚質量濃度(mg/mL);C1-達到吸附平衡時溶液中多酚質量濃度(mg/mL);C2-解析液中多酚質量濃度(mg/mL);V1-吸附液體積(mL);V2-解吸液體積(mL)。

1.2.4 柱層析二級純化單因素工藝實驗 玻璃層析柱內(2.5cm×70cm)按照不同徑高比加入一定量篩選出的最優(yōu)樹脂,濕法裝柱,于柱頂端以一定速度滴加入不同體積以及不同濃度的一級純化液,吸附6h后,先用兩倍柱體積的蒸餾水清洗,除去水溶性雜質,再用上述篩選出的最優(yōu)濃度乙醇進行洗脫,控制不同流速于柱末端收集流出液,每5mL收集1管,測定每管中多酚的濃度(mg/mL)。繪制洗脫曲線,收集濃度最大的60mL。通過計算多酚回收率,并于40℃烘干后復溶,測定多酚含量,計算純度,確定上樣濃度、徑高比、上樣體積以及洗脫流速四個單因素對多酚二級純化效果的影響,并確定最適宜純化條件。

回收率公式:R(%)=C0V0/C1×V1×100

純度公式:P(%)=C2×V2/W×100

表3 9種大孔樹脂對多酚的吸附解析率Table 3 The adsorption and resolution rate of macroporous resins

其中,R-多酚回收率(%);C1-上樣的濃度;V1-上樣的體積;C0-收集液體多酚的濃度(mg/mL);V0-收集液體的體積(30mL);P-多酚純度(%);C2-復溶后多酚的濃度(mg/mL);V2-復溶時定容的體積(mL);W-烘干后的干物質重(mg)。

1.2.5 HPLC-DAD-ESI-MS法分析多酚二級純化物成分

1.2.5.1 樣品準備 取6mg烘干后的多酚粉末用2mL甲醇復溶,配制成濃度為3mg/mL的樣品液,過0.45μm有機微濾膜,備用。

1.2.5.2 高效液相色譜條件 洗脫流動相組成為:溶劑A:水,溶劑B:甲醇溶液;流速為0.400mL/min;進樣量為10μL;檢測器為紫外檢測器,檢測波長為280nm;流動相洗脫程序采用混合溶劑梯度洗脫的方式見表2。

表2 流動相系統(tǒng)配比及梯度洗脫程序Table 2 Ratio of mobile phase and program of gradient elution

1.2.5.3 質譜分析條件 電噴霧電離源(ESI);離子源噴射電壓3.5kV;離子源溫度30℃;負離子檢測模式;氮氣為霧化氣;載氣流速11L/min;紫外檢測器(DAD),檢測波長280nm;全離子掃描方式,質量掃描范圍100～3000amu;破碎電壓100V。

1.2.6 數據分析 本研究所有進行實驗均平行三次,數據表示為:結果±標準差;圖像及圖表分析均采用Excel(2007)、Design-expert(7.0)以及SAS(9.1)軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據1.2.2方法測得沒食子酸標準工作曲線方程為:y=0.01056x+0.0099,其中橫坐標x為沒食子酸質量濃度,縱坐標y為765nm下的吸光值。沒食子酸質量濃度在0～70μg/mL內與其吸光值呈線性關系,相關系數R2=0.9997,表明線性關系良好。根據標準曲線方程按照1.2.4中純度計算公式進行計算,得樟子松樹皮多酚一級純化產物純度為62.06%±1.67%。

2.2 樹脂的靜態(tài)吸附解析

由于大孔樹脂的極性、比表面積、平均孔徑等理化性質的不同,其分離目標物質的效果也不同[16]。大孔樹脂的吸附性能取決于吸附劑與吸附物質之間的氫鍵和范德華力,與其被吸附物的溶解度表面性質和孔結構等特性有關[17-18];9種樹脂對樹皮多酚的吸附率如表3所示:吸附效果較好的為極性以及中等極性的樹脂,其中以S-8樹脂為最好,吸附效果達到96.12%±1.03%;弱極性以及非極性的樹脂吸附效果較差,其中以D3520樹脂為最差,吸附效果僅有73.62%±2.35%;這可能是由于樹皮多酚中含有較多的親水酚羥基,但是含有一些疏水性結構,從而使其成為中等極性物質,易于被極性、中等極性樹脂吸附[19]。

9種樹脂對樹皮多酚的解析率如表3所示:在相同乙醇濃度下,X-5樹脂對多酚的解析效果最佳,這可能是與其具有較大的比表面積以及平均孔徑有關;雖然NKA-2、S-8以及ADS-7三種樹脂對于多酚吸附效果較好,但是解析效果卻很差,分別僅達到11.65%±0.45%、10.31%±1.24%以及3.45%±1.13%,故考慮不適合做純化樹脂。9種樹脂解析率均隨著乙醇濃度的增加先增大后減小,當乙醇濃度為60%時解析率同時達到各自最大值,這可能是由于多酚類物質在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的物質,乙醇濃度較低時不足以破壞多酚類物質與其它物質的連接,導致洗脫下來的多酚較少;而乙醇濃度過高會溶出較多的親脂性較強的雜質成分,這些成分會與多酚類化合物競爭同一乙醇水分子[20]。由于X-5樹脂在不同濃度乙醇下對多酚的解析效果均優(yōu)于其它樹脂,且在乙醇濃度為60%時達到最佳為60.31%±1.98%,因此,選擇X-5作為多酚二級純化樹脂,洗脫劑為60%乙醇。

2.3 動態(tài)洗脫曲線的繪制

根據1.2.4方法測得每管流出液多酚濃度,繪制洗脫曲線如圖1所示:開始時流出液中多酚含量隨著洗脫體積的增加而緩慢增大,當洗脫至第17管時,含量顯著增大,當收集到第21管時流出液中多酚含量達到最大值4.57mg/mL,之后隨著洗脫體積的增加,每管中多酚含量相對之前逐漸下降,28管后多酚含量相對較少,所以本實驗收集17管到28管的60mL樟子松樹皮多酚純化液溶液進行后續(xù)實驗。

圖1 樟子松樹皮多酚動態(tài)洗脫曲線 Fig.1 Dynamic desorption curve of Pinus sylvestris L. bark polyphenols

2.4 上樣濃度對純化效果的影響

當選定洗脫條件上樣體積為40mL、徑高比為1∶25以及洗脫流速為2BV/h時,上樣濃度對樟子松樹皮多酚純度以及回收率的影響如圖2所示:多酚的純度隨著上樣濃度的增加先增大后減小,當上樣濃度為4mg/mL時,多酚純度達到最大值71.21%±1.97%,之后開始逐漸減小,這是由于當樣品濃度較低時樹脂主要吸附多酚類物質,隨著濃度的增加,樹脂的吸附量逐漸增大并趨于吸附平衡;當樣品濃度再增大,樹脂對與多酚競爭吸附的雜質的吸附也隨之增加,因而使解析下來的物質中含有部分醇溶性雜質,導致純度下降;回收率隨著上樣濃度的增加逐漸增大,當上樣濃度為4mg/mL時,回收率達到78.12%±1.57%,之后隨著濃度增加逐漸趨于平緩,因此確定4mg/mL為最適宜上樣濃度。

圖2 上樣濃度對樟子松皮多酚純度和回收率的影響 Fig.2 Effect of sample solution concentration on purity and recovery rate of Pinus sylvestris L. bark polyphenols

2.5 吸附柱徑高比對純化效果的影響

當選定洗脫條件為上樣體積為40mL、上樣濃度為4mg/mL以及洗脫流速為2BV/h時,徑高比對樟子松樹皮多酚純度以及回收率的影響如圖3所示:多酚的純度隨著徑高比的增加先增大后減小,當徑高比為1∶30時,多酚純度達到最大值71.35%±2.22%,之后開始逐漸減小,這可能是由于隨著徑高比的增大,樹脂與洗脫劑的相對接觸面積增大,被吸附的多酚類物質與洗脫劑能夠充分接觸,洗脫效果逐漸增加,而當徑高比過大時,洗脫劑在層析柱中流動時間過久,被解析的多酚類物質易于再次被樹脂吸附,同時部分洗脫劑亦會對被吸附上的醇溶性雜質進行解析,從而降低了多酚類物質的純度;而回收率隨著徑高比的增加變化不大,因此確定1∶30為最適宜徑高比。

圖3 徑高比對樟子松皮多酚純度和回收率的影響 Fig.3 Effect of diameter hight ratio on purity and recovery rate of Pinus sylvestris L. bark polyphenols

2.6 上樣體積對純化效果的影響

當選定洗脫條件為上樣濃度為4mg/mL、徑高比為1∶30以及洗脫流速為2BV/h時,上樣體積對樟子松樹皮多酚純度以及回收率的影響如圖4所示:多酚純度隨著上樣體積的增加先增大后減小,當上樣體積達到60mL時,多酚純度達到最大值72.76%±1.53%;之后開始逐漸減小;當上樣體積為60mL時,回收率達到最大值87.37%±1.18%,之后開始大幅度減小,這是因為隨著上樣體積的增加,樹脂對多酚吸附逐漸達到飽和,當再增加上樣體積時,會超過泄露點,部分溶液漏出,造成吸附不完全,因此確定60mL為最適宜上樣體積。

圖4 上樣體積對樟子松皮多酚純度和回收率的影響 Fig.4 Effect of sample volume on purity and recovery rate of Pinus sylvestris L. bark polyphenols

2.7 洗脫流速對純化效果的影響

當選定洗脫條件為上樣體積為60mL、上樣濃度為4mg/mL以及徑高比為1∶30時,洗脫流速對樟子松樹皮多酚純度以及回收率的影響如圖5所示:多酚純度以及回收率隨著洗脫流速的增加,變化趨勢不明顯,說明洗脫流速對于二者影響甚小;從節(jié)約試劑的角度考慮,選擇2BV/h作為最適宜洗脫流速。

圖5 洗脫流速對樟子松皮多酚純度和回收率的影響 Fig.5 Effect of eluting speed on purity and recovery rate of Pinus sylvestris L. bark polyphenols

經過單因素實驗分析比較,以多酚純度以及回收率為指標得到的樟子松樹皮多酚純化最適宜條件為:上樣濃度4mg/mL、徑高比1∶30、上樣體積60mL以及洗脫流速2.0BV/h,在此工藝條件下得到的樹皮多酚純度為72.99%±0.98%,回收率達到87.26%±2.42%。

2.8 二級純化物主要成分的鑒定

按照1.2.4方法中最適宜條件得到的二級純化物主要成分總離子流色譜圖以及質譜圖如圖6、圖7所示,通過質譜信息與國內外相關文獻進行比較初步鑒定,得出物質信息見表4。

圖6 二級純化物主要成分色譜圖 Fig.6 The chromatogram of main composition of secondary purification product

圖7 二級純化物主要成分總離子質譜圖 Fig.7 The mass spectra of main composition of secondary purification product

如表4所示:1號峰的分子離子峰是865,該質譜信息與Laura M.Bystrom[21]研究的montgomery水果中含有的原花青素三聚體的信息是一致的。在蘋果[22]中也發(fā)現(xiàn)過這種原花青素的三聚體;2號峰的分子離子峰是577,該質譜信息與原花青素二聚體B2是相同的[23-25],因此可以初步確定2號峰是原花青素二聚體B2;3號峰的分子離子峰是349,Dongmei Wang等人[26]研究的桂花香茶葉子中發(fā)現(xiàn)過類似信號峰;4號峰的分子離子峰是289,是典型的的表兒茶素信號峰,這與文獻報道在原花青素二聚體被洗脫后,出現(xiàn)表兒茶素的情況是類似的[27]。7號峰的分子離子峰是303,初步判定為鞣花酸,這與M.C. Díaz-García等人[28]通過研究果汁建立的多酚類物質質譜庫中出現(xiàn)的信息是一樣的。

表4 二級純化物主要成分質譜分析Table 4 The Mass spectrogram analysis of main composition of secondary purification product

3 結論

在溶液混合組分共存的體系中,X-5大孔樹脂對樟子松樹皮多酚吸附解析效果較好,當洗脫劑乙醇濃度達到60%時,解析率達到最佳60.31%±1.98%。

通過單因素實驗得到最適宜條件為上樣濃度4.0mg/mL,徑高比1∶30,上樣體積60mL,洗脫流速2BV/h。經X-5大孔樹脂純化,樟子松樹皮多酚純度由62.06%±1.67%提升到72.99%±0.98%。

通過HPLC-DAD-ESI-MS分析法初步確定樟子松樹皮二級純化物中主要成分可能為:原花青素三聚體、原花青素二聚體B2、5-鄰-沒食子?；崴?、表兒茶素以及鞣花酸。說明二級純化物中主要為多酚以及原花青素類物質。

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