李秀景，尹儉儉，鄭叢龍，丁 寧

(1.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 大連116622;2.鄒平縣中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 鄒平256200)

流感病毒屬于正黏病毒科，是單負(fù)鏈RNA 病毒，通過(guò)呼吸道傳播，曾多次引起全球流感大流行，每次流行都造成了嚴(yán)重的人力和物力的損失［1-2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道:每年流感全球流行可引起300 ～500 萬(wàn)人發(fā)病，導(dǎo)致2 ～5 萬(wàn)人死亡［3］，受到流感感染的人口約20% ～40%，且流感導(dǎo)致的死亡率也在增加［4］。2009年3月在墨西哥暴發(fā)的甲型H1N1 流感，傳播迅速，世界衛(wèi)生組織于2009年6月11日便將全球流感疫情警戒等級(jí)提高到了第六級(jí)。2013年3月在中國(guó)暴發(fā)的H7N9 禽流感，截至5月30日有132 人感染，33 人死亡。目前，臨床上常用的流感的治療和預(yù)防方法是藥物治療和接種疫苗，藥物多為口服藥，疫苗的接種多為肌肉注射。流感病毒的感染和病毒的復(fù)制主要發(fā)生在上呼吸道上皮細(xì)胞，病毒一般不入血，但常引起機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)和全身性反應(yīng)［5］。局部治療和預(yù)防可以利用呼吸道黏膜的免疫作用，對(duì)病毒的感染和復(fù)制起到一定的抑制作用，減輕局部炎癥反應(yīng)。呼吸道黏膜不僅是呼吸道病毒入侵機(jī)體的主要門(mén)戶(hù)，也是機(jī)體防御病毒感染的重要部位。覆蓋著一層假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞，纖毛不停的擺動(dòng)，具有機(jī)械的屏障作用，呼吸道黏膜上皮的杯狀細(xì)胞和粘液腺的上皮細(xì)胞能分泌粘液，通過(guò)纖毛活動(dòng)和上皮細(xì)胞分泌的粘液可以阻擋和排除外界有害的刺激因子。呼吸道黏膜部位有游走的或固定的吞噬細(xì)胞，其能夠吞噬病原微生物;且黏膜下層豐富的淋巴網(wǎng)能夠阻留和破壞病原微生物。正常人的呼吸道黏膜上皮細(xì)胞由于接受某些病毒的隱性感染，常含有一定量的干擾素，可對(duì)病毒發(fā)生干擾作用。因此，流感病毒的局部治療和預(yù)防即呼吸道黏膜給藥的用藥方法可以作為今后抗流感研究的一個(gè)重要方向，如鼻腔給藥，其使用方便，可隨時(shí)自行給藥，患者依從性好［6］。

1 流感的局部治療

1.1 流感治療現(xiàn)狀

流感病毒一旦進(jìn)入和定植于呼吸道上皮，經(jīng)吞飲作用，黏附和穿入柱狀上皮細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。持續(xù)4 ～6 h，新的病毒粒子從細(xì)胞膜上芽生，借神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的作用而釋放，再感染鄰近的柱狀上皮細(xì)胞，短期內(nèi)致大量呼吸道上皮細(xì)胞受染，受染細(xì)胞發(fā)生壞死、脫落及局部炎癥反應(yīng)。目前，臨床上常用的流感的治療方法是藥物治療，常用藥有干擾病毒M2 蛋白功能的藥物即離子通道抑制劑，其代表藥為金剛烷胺和金剛乙胺，以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其代表藥為奧司他韋和扎那米韋。金剛烷胺和金剛乙胺作用靶點(diǎn)為M2 蛋白四聚體形成的離子通道，通過(guò)阻礙H+流向病毒粒子內(nèi)部，使病毒粒子內(nèi)部pH 值居高不下，從而阻礙病毒血凝素(hemagglutinin，HA)構(gòu)象的改變，使HA1和HA2 不能分離，阻礙了病毒膜和內(nèi)體膜的融合，使病毒脫衣殼受阻。奧司他韋和扎那米韋通過(guò)與流感病毒NA 的酶活性點(diǎn)的保守殘基段的不同部位特異性結(jié)合，從而造成酶活性喪失，使依附在糖蛋白和糖脂上的末端唾液酸不能裂解，從而導(dǎo)致流感病毒子代毒粒不能從感染細(xì)胞表面釋放和阻斷了病毒的播散［7-8］。由于單鏈RNA 病毒缺乏自我校正的機(jī)制，在藥物的作用下，其突變頻率會(huì)明顯增高［10］，對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，2008—2009年在美國(guó)幾乎100%的季節(jié)性H1N1 病毒對(duì)奧司他韋具有了耐藥性，以及幾乎所有的H3N2 病毒對(duì)金剛烷胺也產(chǎn)生了耐藥性［10］。2010年8月，WHO 報(bào)告的全球15 000 個(gè)甲型H1N1 流感臨床標(biāo)本中，312 個(gè)對(duì)磷酸奧司他韋耐藥，未發(fā)現(xiàn)對(duì)扎那米韋耐藥的病毒株在流行傳播［11］，但在其作用下遲早會(huì)產(chǎn)生耐藥基因的突變。隨著甲型H1N1 流感的蔓延以及甲型H1N1 流感病毒對(duì)達(dá)菲耐藥的出現(xiàn)，安全、有效的流感治療藥物和治療方法的研究顯得尤為重要。

1.2 流感局部治療的研究

流感病毒主要吸附纖毛上皮細(xì)胞以及含α -2，6 半乳糖苷唾液酸豐富的氣管和支氣管上皮細(xì)胞，若將藥物經(jīng)局部給藥直接作用于纖毛上皮細(xì)胞以及氣管和支氣管上皮細(xì)胞，從而減少流感病毒的傳播?，F(xiàn)在研究比較多的黏膜給藥的藥物有干擾素、納米金屬和一些中藥。

干擾素是一種可以抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子，其作用于細(xì)胞的干擾素受體，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生化過(guò)程，激活細(xì)胞基因表達(dá)多種抗病毒蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的抑制作用。臨床上常用干擾素的劑型多為肌肉或靜脈注射給藥，但其對(duì)病毒引起的局部皮膚或黏膜感染的體內(nèi)半衰期短，增加其給藥量會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的副作用。馬天舒等［12］研究表明，rhIFN α-2b 滴鼻劑能增強(qiáng)小鼠的NK 細(xì)胞的活性，刺激機(jī)體產(chǎn)生分泌型IgA 的含量升高，顯著提高機(jī)體的免疫力。因此，干擾素的局部給藥對(duì)流感的治療具有現(xiàn)實(shí)意義。王蓉等［13］用小劑量干擾素經(jīng)口腔噴灑給藥作用于小鼠，證實(shí)小劑量干擾素口腔局部給藥能夠預(yù)防和治療流感病毒的感染;蔣為民等［14］證實(shí)重組IFN α -2b 含片經(jīng)口腔黏膜給藥15 d 時(shí)，明顯降低流感病毒所致的小鼠死亡率，并明顯延長(zhǎng)其存活時(shí)間，并且肺部病變程度明顯減輕。杭州中心血站成功試制了人白細(xì)胞干擾素滴鼻劑并通過(guò)了鑒定，其對(duì)流感治療的顯效率為47.8%，總有效率為89.4%。黃宇等［15］研究證實(shí):重組人干擾素α -2a 滴鼻劑在100 萬(wàn)IU/mL 及其以上濃度對(duì)小鼠流感病毒性肺炎有明顯的治療作用。

納米醫(yī)學(xué)研究在生物醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外關(guān)于納米銀在抗菌作用方面的研究報(bào)道很多。目前，F(xiàn)ujimori Y 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，納米碘化銅粒子溶于水溶液經(jīng)鼻腔給藥后對(duì)2009年的H1N1甲型流感病毒具有抗病毒活性;并且納米碘化銅粒子的抗流感病毒活性呈劑量依賴(lài)性。電子自旋共振光譜分析顯示納米碘化銅粒子在水溶液中能夠產(chǎn)生羥自由基，從而起到抗病毒活性;SDS -PAGE 分析證實(shí)，納米碘化銅顆粒能夠降解流感病毒表面的血凝素和神經(jīng)氨酸酶使病毒失活。

2 流感的局部預(yù)防

2.1 流感的預(yù)防現(xiàn)狀

接種疫苗是預(yù)防和控制流感的最有效的策略，接種疫苗可以降低流感病毒所導(dǎo)致的病人的發(fā)病率和死亡率［17］。目前應(yīng)用的流感疫苗有3 種［18］:(1)全病毒疫苗，是由完整的流感病毒顆粒組成的，其包含表面抗原和內(nèi)部抗原，具有良好的免疫原性，其反應(yīng)原性也較強(qiáng);但病毒包膜中的類(lèi)脂質(zhì)屬于致熱原，常常引起發(fā)熱反應(yīng)。(2)裂解病毒疫苗，是用裂解劑將流感病毒裂解、純化后制成的;該疫苗去除了病毒核酸和大分子蛋白，但保留了血凝素和神經(jīng)氨酸酶以及部分基質(zhì)M 蛋白和核蛋白;與全病毒疫苗相比，其免疫原性和安全性均較好，目前被廣泛使用于國(guó)內(nèi)外。(3)亞單位疫苗，是流感病毒經(jīng)裂解和進(jìn)一步純化后獲得的僅含血凝素和神經(jīng)氨酸酶的疫苗，其安全、有效以及不良反應(yīng)少。雖然流感病毒疫苗具有保護(hù)流感病毒肺部感染的作用，但其效果與情緒及機(jī)體的機(jī)能狀況有密切的關(guān)系，當(dāng)機(jī)體狀態(tài)不佳時(shí)，使產(chǎn)生的抗體和殺傷T 淋巴細(xì)胞減少，而且在接種疫苗的14 d 內(nèi)對(duì)機(jī)體無(wú)保護(hù)作用［19-21］。流感病毒的聚合酶具有錯(cuò)配的傾向，導(dǎo)致血凝素或神經(jīng)氨糖酸苷酶的基因突變不斷累積，HA 蛋白的抗原變異會(huì)改變?nèi)祟?lèi)對(duì)流感病毒的易感性，造成抗體的針對(duì)性變?nèi)?。滅活疫苗的生產(chǎn)效率低，一旦流感開(kāi)始流行，其特異性的流感病毒疫苗的生產(chǎn)不能夠滿足急切的全球需求量。因此，流感的預(yù)防面臨著重大的挑戰(zhàn)。

2.2 流感局部預(yù)防的研究

目前，流感病毒的局部預(yù)防研究比較多的是經(jīng)鼻腔給予乳酸菌和經(jīng)鼻腔接種疫苗。Youn HN等［22］，經(jīng)鼻腔給藥給予每只小鼠107和108cfu 的活性乳酸菌，連續(xù)滴鼻21 d 后，用流感病毒感染小鼠，結(jié)果顯示，其能夠明顯提高流感小鼠的存活率;取其肺臟測(cè)得IgA 和白細(xì)胞介素-12 的含量增加，從而起到抗流感的作用。后來(lái)Youn HN 等［23］又研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻腔給予每只小雞500 μL 的1.5 ×109cfu 發(fā)酵乳酸菌CJL-112，連續(xù)給予7 d，用H9N2 流感病毒感染小雞，然后將這些感染了流感病毒的小雞與正常小雞一起圈養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與其一起圈養(yǎng)的正常小雞的胃腸道脫落物和呼吸道脫落物的病毒含量均降低，說(shuō)明發(fā)酵乳酸菌CJL -112 能夠降低流感病毒的傳播。Izumo T 等［24］鼻腔給予BALB/c 小鼠戊糖乳酸桿菌S - PT84，1 次/d，連續(xù)給藥3 d，用流感病毒PR8 感染小鼠，其存活率隨著S -PT84 劑量的增加而增高，并且其鼠肺灌洗液中病毒滴度與對(duì)照組相比降低;S - PT84 滴鼻組鼠肺灌洗液中白細(xì)胞介素-12 和干擾素-α 的水平顯著提高，并且其肺中的自然殺傷細(xì)胞的活性顯著增強(qiáng)。Harata G 等［25］給BALB/c 小鼠滴鼻鼠李糖乳酸菌GG(LGG)3 d，然后用流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)感染小鼠，LGG 組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，其出現(xiàn)流感癥狀的頻率減低，生存率增高;并且LGG 組小鼠的白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的mRNA 的表達(dá)量明顯增多。

目前經(jīng)鼻腔進(jìn)行疫苗接種已成為研究的熱點(diǎn)，Illum 等［26］成功研制了白喉疫苗粉劑，然后將白喉疫苗普通粉劑和白喉疫苗殼聚糖粉劑分別鼻腔給藥與傳統(tǒng)的白喉疫苗接種進(jìn)行比較，殼聚糖組更加安全、有效，并能誘發(fā)細(xì)胞免疫。Esposito S 等［27］研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的三價(jià)滅活疫苗相比，活性減弱的流感疫苗鼻腔接種能夠增強(qiáng)其在小孩和老年人體內(nèi)的免疫原性，其對(duì)小孩和青少年的免疫效率明顯增高。由于疫苗接種后免疫原性較弱，現(xiàn)在研究中多添加佐劑。Kang H 等［28］將滅活的H9N2 輔以佐劑CpG DNA 和膽酸鈉鼻腔接種于10日齡的鴨子，其能增強(qiáng)鴨子是局部免疫反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)，經(jīng)鼻腔接種的鴨子的咽喉、氣管和血清中的特異性IgA 和IgG 抗體水平，并且增加了氣管和肺中的白細(xì)胞介素-2 和白細(xì)胞介素-6，增強(qiáng)了其對(duì)流感的預(yù)防作用。

3 展 望

流感病毒經(jīng)呼吸道傳播，能夠引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，有時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。因其變異快，控制其危害仍是醫(yī)學(xué)界的一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。由于流感病毒主要吸附于纖毛上皮細(xì)胞以及含α -2，6 半乳糖苷唾液酸豐富的氣管和支氣管上皮細(xì)胞上，一般不入血，所以呼吸道上皮細(xì)胞是其復(fù)制和增殖的主要場(chǎng)所。有研究顯示，重組合成的唾液酸融合蛋白DAS181，作用于細(xì)胞表面的唾液酸抑制流感病毒的感染，從而有效地預(yù)防和治療流感［29］。有研究證實(shí)，人呼吸道胰蛋白酶活性蛋白酶(HAT)和跨膜蛋白酶絲氨酸S1 -2(TMPRSS2)在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)能夠抑制HA 的分裂，從而阻礙流感病毒的復(fù)制［30］。目前，治療流感的藥物多為口服藥，存在肝臟首過(guò)效應(yīng)，使藥物的生物利用度減低。局部給藥如鼻腔給藥，克服了這些缺點(diǎn)，而且使用方便，患者依從性好，起效速度快。因此，流感的局部治療和預(yù)防將成為流感研究中的重要方向。

［1］ Fedso DS. Vaccine development for an imminent pandemic:why we should worry，what we must do［J］. Hum Vaccine，2006，2(1):38 -42.

［2］ Hampson AW. Vaccines for Pandemic Influenza. The History of our Current Vaccines，their Limitations and the Requirements to Deal with a Pandemic Threat［J］. Ann Acad Med Singapore，2008，37(6):510 -517.

［3］ Taia TW，Gene ST，Rong H，et al. Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins［J］. PLoS Pathog，2010，6(2):e1000796.

［4］ Kamol S，Thaweesak C，Chitima T，et al. Molecular Evolution of Human H1N1 and H3N2 -IFV Influenza A Virus in Thailand，2006—2009［J］. PLoS One，2010，5(3):e9717.

［5］ Towatari T，Ide M，Ohba K，et al. Identification of ectopic anionic trypsin 1 in rat lungs potentiating pneumotropic virus infectivity and increased enzyme level after virus infection［J］. Eur J Biochem，2002，269(10):2613 -2621.

［6］ 楊莉，高穎昌，趙志剛. 鼻腔給藥的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41(22):1685 -1688.

［7］ Yu K，Luo C，Qin G. Why are oseltamivir and zanamivir effective against the newly emerged influenza A virus (A/H1N1)?［J］. Cell Res，2009，19(10):1221 -1224.

［8］ Matrosovich MN，Matrosovich TY，Gray T，et al. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium［J］. J Virol，2004，78(22):12665 -12667.

［9］ 陳鴻珊，張興權(quán). 抗病毒藥物及其研究方法［M］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:113 -122.

［10］ Dharan NJ，Gubareva LV，Meyer JJ，et al. Infections with oseltamivir - resistant influenza A(H1N1)virus in the United States［J］. JAMA，2009，301(10):1034 -1041.

［11］ Bloom JD，Gong LI，Baltimore D. Permissive secondary mutations enable the evolution of influenza oseltamivir resistance［J］. Science，2010，328(5983):1272 -1275.

［12］ 馬天舒，賈玉紅，葛迎春，等. 重組人干擾素α -2b滴鼻劑對(duì)小鼠免疫功能影響的研究［J］. 中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(4):264 -266.

［13］ 王蓉，楊靜，黃文芳. 小鼠口腔局部使用干擾素的抗流感病毒實(shí)驗(yàn)研究［J］. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19(2):14 -16.

［14］ 蔣為民，田建明，王妍，等. 重組人α -2b 干擾素含片藥效學(xué)試驗(yàn)［J］. 中國(guó)生化藥物雜志，2006，27(1):32 -34.

［15］ 黃宇，王悅增，王麗，等. 重組人干擾素α-2a 滴鼻劑抗病毒藥效學(xué)研究［J］. 微生物學(xué)雜志，2006，26(3):61 -64.

［16］ Fujimori Y，Sato T，Hayata T，et al. Novel Antiviral Characteristics of Nanosized Copper(I)Iodide Particles Showing Inactivation Activity against 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus［J］. App Envir Microbiol，2012，78 (4):951 -955.

［17］ CDC. Prevention and Control of Influenza with Vaccines:Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP)-United States，2012 -13 Influenza Season［J］. MMWR，2012，61(32):613 -618.

［18］ 徐冰，王樹(shù)巧，謝廣中. 流行性感冒疫苗免疫現(xiàn)狀與展望［J］. 中國(guó)計(jì)劃免疫，2005，11(5):409 -413.

［19］ Guo L，Zheng M，Ding Y，et al. Protection against multiple influenza A virus subtypes by intranasal administration of recombinant nucleoprotein［J］. Arch Virol，2010，155(11):1765 -1775.

［20］ Hessel A，Schwendinger M，F(xiàn)ritz D，et al. A pandemic influenza H1N1 live vaccine based on modified vaccinia Ankara is highly immunogenic and protects mice in active and passive immunizations［J］. PLoS One，2010，5(8):e12217.

［21］ Miller GE，Cohen S，Pressman S，et al. Psychological stress and antibody response to influenza vaccination:when is the critical period for stress，and how does it get inside the body?［J］. Psychosom Med，2004，66(2):215 -223.

［22］ Youn HN，Lee DH，Lee YN，et al. Intranasal administration of live Lactobacillus species facilitates protection against influenza virus infection in mice［J］. Antiviral Res，2011，93(2012):138 -143.

［23］ Youn HN，Lee YN，Lee DH，et al. Effect of intranasal administration of Lactobacillus fermentum CJL - 112 on horizontal transmission of influenza virus in chickens［J］.Poult Sci，2012，91(10):2517 -2522.

［24］ Izumo T，Maekawa T，Ida M，et al. Effect of intranasal administration of Lactobacillus pentosus S-PT84 on influenza virus infection in mice［J］. Int Immunopharmacol，2010，10(9):1101 -1106.

［25］ Harata G，He F，Hiruta N，et al. Intranasal administration of Lactobacillus rhamnosus GG protects mice from H1N1 influenza virus infection by regulating respiratory immune responses［J］. Lett Appl Microbiol，2010，50(6):597 -602.

［26］ Illum L. Nasal drug delivery-possibilities，problems and solutions［J］. J Controlled Release，2003，87(1 -3):187 -198.

［27］ Esposito S，Montinaro V，Groppali E，et al. Live attenuated intranasal influenza vaccine［J］. Hum Vaccin Immunother，2012，8(1):76 -80.

［28］ Kang H，Wang H，Yu QH，et al. Effect of intranasal immunization with inactivated avian influenza virus on local and systemic immune responses in ducks［J］. Poult Sci，2012，91(5):1074 -1080.

［29］ Malakhov MP，Aschenbrenner LM，Smee DF，et al. Sialidase Fusion Protein as a Novel Broad -Spectrum Inhibitor of Influenza Virus Infection［J］. Antimicrob Agents Chemother，2006，50(4):1470 -1479.

［30］ Lee SM，Yen HL. Targeting the host or the virus:Current and novel concepts for antiviral approaches against influenza virus infection［J］. Antivir Res，2012，96(3):391 -404.