孫星邈，王 政，李曙光，孟凡凡，王曙明，張井勇

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所/大豆國家工程研究中心，長春 130033）

硬實（硬粒hard seed，Hardseededness）是種子休眠類型之一，在植物種子中廣泛存在，農(nóng)作物中最常見于豆科作物。硬實是指由于種皮致密、不透水或透水性差而不能吸脹發(fā)芽，又被稱為不透水或石種子（impermeable or stone seeds）。

在大多數(shù)情況下，硬實并非人們所需要的特性，大豆硬實種子即使經(jīng)過長時間浸種或在合適的溫濕度條件下，長達(dá)8d時間種子仍不能吸收水分發(fā)芽，這樣就會在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中嚴(yán)重影響播種品質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)芽延遲，出苗率差，出苗不整齊，進而造成田間保苗密度不同，易于滋生雜草，最終降低了收獲產(chǎn)量[1-2]；并且連作時會造成后作大豆種子混雜。此外，在大豆食品加工利用過程中，硬實不僅會影響全粒用型（whole-soy foods）大豆，如豆芽、納豆、烘烤型大豆食品的感觀品質(zhì)，而且會降低大豆原料在豆腐、味噌（miso，日本豆面醬）、豆?jié){與醬油等（cracked-soy foods）加工過程中的碾磨品質(zhì)，剔除硬實種子必然會提高成本[3-4]。因此，在育種實踐中，育種者傾向于選育非硬實的大豆品種。

然而，在收獲時遇到高溫多雨天氣，以及對于大豆貯藏、運輸和種質(zhì)資源保存而言，由于硬實大豆質(zhì)地堅硬種子不易吸收水分，有利于延緩種子劣變、生活力下降，通過將硬實基因引入某些品種，增強種皮保護作用延緩種子老化變質(zhì)[5]，使得利用硬實特性成為保存種質(zhì)資源的途徑之一[6]。

針對硬實在生產(chǎn)實踐、食品加工過程中存在的弊端，以及硬實在防止種子發(fā)生劣變方面的優(yōu)勢，從大豆硬實發(fā)生的原因與影響因素，解除方法以及應(yīng)用潛力方面進行討論。

1 大豆硬實發(fā)生的原因與影響因素

1.1 大豆硬實的發(fā)生原因

大豆的種皮、種臍、合點、種孔等均與硬實的形成密切相關(guān)。

種皮的影響作用最大，其中種皮厚度影響不大，種皮滲透性影響起主要作用。大豆種皮從外到里依次由角質(zhì)層，表皮層，表皮下層以及薄壁細(xì)胞層組成。其中，角質(zhì)層通常由沉積在種子表面的蠟質(zhì)、脂質(zhì)半纖維素或果膠質(zhì)組成[7]，一定程度上阻礙種子的吸水。Ma等報道了大豆可滲透性種子（正常）與不滲透性種子（硬實）的關(guān)鍵區(qū)別，是種子最外面的連續(xù)性角質(zhì)層是否完整[8]。利用掃描電子顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)可滲透性種子的角質(zhì)層存在細(xì)微的裂痕，大多數(shù)裂縫在于種子背側(cè)，吸脹時一般是種皮背側(cè)首先出現(xiàn)皺縮；而硬實種子的角質(zhì)層保持完整，沒有裂痕，使得水分不能通過種皮的角質(zhì)層。此外角質(zhì)層之下的表皮層又稱柵欄層，其細(xì)胞內(nèi)的纖維質(zhì)物質(zhì)及栓化層可在柵欄層外端形成致密區(qū)域，對種皮的不透性具有重要作用[9-11]。Meyer等進一步證實種皮缺乏透性是硬實種子吸取水分的限制因素[2]，硬實種子種皮的導(dǎo)水率小于非硬實的導(dǎo)水率；除去種皮后，硬實與非硬實種子單獨的種胚吸收水分的速率相當(dāng)。

當(dāng)處于潮濕條件時，種子種臍、合點、種孔等結(jié)構(gòu)關(guān)閉會阻止外界水分和水汽進入，這是形成種子硬實的另一主要原因[10,12]。種臍是鑒別豆科種子穩(wěn)定的重要特征，臍縫處可能有兩層?xùn)艡趯蛹?xì)胞，其中一層位于角質(zhì)層外側(cè)，稱為反向柵欄層，他會形成一個控制水分進出的閥門結(jié)構(gòu)，只允許水分散出而阻止其進入。朱麗偉等證明不論在何種相對濕度條件下[13]，硬實種子的種臍臍縫寬度均顯著小于非硬實種子，且隨環(huán)境改變硬實種子的臍縫變化幅度小于非硬實種子。

大豆種皮中較高的鈣質(zhì)含量也是形成硬實的重要原因之一。Chen等證明種皮鈣質(zhì)含量與種子硬實呈正相關(guān)[14]，但是受到土壤類型、溫度變化等環(huán)境影響而表現(xiàn)不一致。朱麗偉等對多種豆科植物硬實種子研究也發(fā)現(xiàn)硬實種皮中的大部分礦質(zhì)元素（Mg、Al、Si、K、Ca、Fe、Cu、Zn等）含量均顯著高于非硬實種子[13]，推測高的礦質(zhì)元素含量增加了硬實種子的耐壓能力，種皮不易產(chǎn)生裂縫，進而降低了滲水性形成硬實。

1.2 大豆硬實的影響因素

大豆種子的硬實形成受內(nèi)部因素和外部因素的共同制約。內(nèi)因主要為種子成熟程度和自身遺傳因素；外因包括成熟過程中土壤水分和養(yǎng)分供應(yīng)情況以及收獲之后貯藏、運輸過程中的空氣相對濕度和溫度變化等外界環(huán)境因子。

1.2.1 影響硬實內(nèi)部因素 硬實的形成和種子本身的成熟度有關(guān)，未充分成熟的種子不會發(fā)生硬實，硬實是種子成熟到一定程度才出現(xiàn)的，這一現(xiàn)象與種子的含水量有關(guān)。隨著種子的不斷成熟，含水量逐漸降低，種皮外層的厚壁柵欄細(xì)胞開始發(fā)育，種皮逐漸硬化，完全成熟時柵欄細(xì)胞收縮引起硬實產(chǎn)生[12]，許多豆科植物均在此時產(chǎn)生休眠[15-16]。

研究表明這一系列的變化受遺傳控制，但在顯隱性關(guān)系和基因數(shù)目上結(jié)論均存在爭議。早期研究認(rèn)為種子的吸水性至少是部分顯性或為1個顯性單基因控制；Kilen和Hartwig利用大豆“Tracy”（非硬實）דD67-5679”（硬實）正反交組合[17]，認(rèn)為硬實受3個主基因控制，軟實對硬實為顯性；Verma和Ram對6個親本正反交各自產(chǎn)生的F1、F2、F3代籽粒進行種子滲透性分析[18]，同樣認(rèn)為軟實對硬實為顯性，但不同組合受不同數(shù)目的顯性基因控制。張?zhí)降妊芯緿86-4448（硬粒）×商用大豆品種A6297（正常粒）的F2群體則認(rèn)為，硬粒性狀受2個主基因控制，基因間有累加效應(yīng)，硬實為顯性。Shahi和Pandey認(rèn)為該性狀受1個基因控制[19]，但顯隱關(guān)系研究與選用品種有關(guān)，亞種間雜交時，硬實為顯性，品種間雜交時，硬實為隱性。因此在經(jīng)典遺傳學(xué)水平研究硬實，由于試驗材料遺傳背景不同，得出的結(jié)果有較大差異，同時也說明了硬實性狀受基因控制的復(fù)雜性。

隨著分子遺傳研究的開展，硬實逐漸被作為復(fù)雜數(shù)量性狀進行研究，Keim等在亞種間雜交時[20]，5個RFLP標(biāo)記以及這些標(biāo)記間上位性互作可以解釋71%的硬實遺傳變異，鑒定了i位點（QTL）可解釋該分離群體32%的遺傳變異；Zhang等利用874個SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了多環(huán)境下穩(wěn)定遺傳的2個QTL（Ha1和Ha2）[4]，分別位于LGL、D1a連鎖群上，目前正在多個遺傳背景下進行驗證。

1.2.2 影響硬實外部因素 大豆生長后期的環(huán)境，包括地區(qū)的氣候、降雨、灌溉、太陽光輻射和土壤鈣質(zhì)含量等因素均會影響硬實的發(fā)生。結(jié)莢鼓粒期是大豆需水的關(guān)鍵期，高溫干旱不僅會影響水分吸收和營養(yǎng)物質(zhì)的積累，造成高溫逼熟，飽滿度差，落莢嚴(yán)重，豆莢空癟率高，大豆減產(chǎn)嚴(yán)重，而且會大大增加硬實率，Vieira等在試驗中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下大豆硬實種子比例增加[21]，這一現(xiàn)象在小粒型種子中尤為明顯，成熟時干旱會使種子的萌發(fā)推遲3d左右。馬盾和劉健研究顯示秋大豆一般比夏大豆硬實多[22]，推測也是由秋大豆在干燥季節(jié)成熟引起?；谟矊崒Ω珊禇l件的敏感，灌溉條件也會對硬實產(chǎn)生明顯影響，季良和張振泰對北疆地區(qū)灌水模式進行研究發(fā)現(xiàn)[23]，灌水量和灌水次數(shù)均會影響大豆硬實情況，即較少灌水量對大豆硬實形成影響顯著，在同一灌水次數(shù)下，灌水量越大，硬實率越低，偏旱年份灌水量對硬實率的影響大于灌水次數(shù)。另外土壤中鈣質(zhì)含量高，硬實就多；鈣質(zhì)含量少，硬實種子就少[12]。太陽光輻射時間越長，強度越大，硬實率也越高[24]。

成熟收獲后的貯藏條件也會對硬實形成產(chǎn)生重要影響，濕度與溫度是貯藏中形成硬實的2個最重要的外部因素。非硬實的種子，隨著進一步干燥，會造成二次休眠，因此貯藏時相對濕度降低會增加種子硬實率，在菜豆冬季貯藏試驗中，當(dāng)含水量由16%降到10%時，有近半數(shù)的種子會形成硬實[25]。這種現(xiàn)象可能是因為含水量降低可使種皮柵狀細(xì)胞更加收縮，結(jié)構(gòu)更為緊密造成的。除干燥條件會影響種子的休眠和硬實外，恒溫貯藏時，溫度較高則休眠率下降較快[26]。

2 大豆硬實的破除方法

2.1 機械劃破種皮

采用機械處理的方式擦破種皮可能是最為普遍的處理硬實種子的方法，劃破種皮使得空氣和水分能夠透過種皮，促使種子快速吸水和萌發(fā)。當(dāng)處理少量的大粒種子時，可以在除種臍以外種皮上側(cè)向切掉一小塊至露出子葉，李忠賢利用刀片劃破硬實大豆種皮[27]，除個別種子霉?fàn)€外，平均發(fā)芽率達(dá)到96%以上，由此說明機械方法對于破除硬實效果明顯。批量處理也可在采用砂紙磨擦、在研缽中與粗砂混勻研磨及機械磨擦的方法，但處理程度應(yīng)損傷種皮但不傷及種胚部位，因此不宜處理大批量大粒種子。在處理批量的種皮較薄的小種子可選用硬實種子碰撞機、小型種子磨擦機、電動磨米機等磨傷種皮打破硬實[28]。

2.2 溫度處理

溫度的變化可改變大豆種皮透性，可破除休眠并改變發(fā)芽率。將種子置于高溫（熱水）中一段時間后冷卻是破除休眠的主要方法之一。但每一種豆科植物種子都存在一個休眠破除的臨界溫度[29]，因此處理的具體時間和溫度需根據(jù)種子大小與種皮厚度而定。除高溫處理外，低溫處理也可破除硬實、結(jié)束休眠；具體方法包括冷凍處理和低溫層積。冷凍處理后可改變種皮透性，也可用液態(tài)氮處理；低溫層積是將種子在較低溫度下置于濕潤的發(fā)芽床或其他基質(zhì)中層積處理，可在豆科牧草打破硬實過程中應(yīng)用，鄭月萍對野生大豆研究也發(fā)現(xiàn)，4℃的層積處理80d可顯著破除種子硬實，萌發(fā)率顯著上升。

2.3 干濕交錯處理

將浸泡和干燥交錯進行，多次反復(fù)后種皮既吸脹又收縮，可破壞種皮結(jié)構(gòu)，提高種皮透性，適于處理大粒種皮較薄的硬實大豆種子。生產(chǎn)上通常是將硬實種子置于水中浸泡，白天放在太陽下曝曬，夜間轉(zhuǎn)至涼爽處，多次反復(fù)，當(dāng)大部分種子膨脹時根據(jù)墑情播種。

2.4 化學(xué)處理

濃硫酸和高濃度NaOH可以腐蝕局部種皮，增大種皮的透性，有效打破種子休眠，其中濃硫酸處理較為常用?；瘜W(xué)處理方法經(jīng)濟有效，但由于強酸、強堿對種胚的腐蝕傷害，應(yīng)用此方法存在3點問題：（1）不同硬實種子耐受酸堿能力不同，特別是濃硫酸處理速度較快，對于種皮較薄的種子處理時間較難控制；（2）化學(xué)殘留對種子危害大，處理后的沖洗要徹底；（3）蟲害較嚴(yán)重但仍有萌發(fā)能力的種子，強酸、強堿容易通過傷口傷害種子，不適用此方法。所以在批量處理種子前，一定要進行預(yù)備試驗，確定合適的處理時間和使用濃度，避免達(dá)不到預(yù)期效果或者傷害種子本身[12,16]。

3 大豆硬實的應(yīng)用潛力

在農(nóng)業(yè)實踐上，硬實種子堅硬的種皮有利于種子在很長時期內(nèi)保持較強的活力，對于控制種子的休眠萌發(fā)和延長種子壽命具有重要的指導(dǎo)意義。

種皮阻礙了水分和空氣的擴散，在成熟收獲之前，遇到不良天氣情況，硬實可防止種子循環(huán)吸水和干燥；在開放貯存情況下，硬實延緩了吸取周圍環(huán)境中的水汽，而且還可以抵抗貯存時溫度和濕度的波動對種子的損傷[30]。Heatherly等針對經(jīng)歷高溫高濕等不利存放條件[31]，普通大豆種子發(fā)芽率下降的情況，對兩地硬實大豆種子和非硬實種子試驗發(fā)現(xiàn)，置于同等不利條件下20d后，非硬實種子發(fā)芽率下降超過70%，但硬實種子發(fā)芽率僅下降20%左右，證明硬實大豆種子在自然環(huán)境下可更好的保持發(fā)芽率。王金龍等試驗驗證了大豆種子的儲存壽命，證明為保證生活力非硬實種子僅可在室溫下保存2a，但硬實種子室溫貯存4a仍可保持發(fā)芽率。且硬實種子遺傳基礎(chǔ)未發(fā)生改變，不影響后代植株的植物學(xué)性狀。

因此硬實對種質(zhì)的保存是有利的，有目的地選育具有部分程度硬實的品種，可以提高種子的生活力；同時可以通過制造干燥和低溫環(huán)境形成硬實，貯藏珍貴大豆材料。

4 小結(jié)與展望

硬實是大豆種子中常見的休眠特性，種皮缺乏透性是硬實大豆形成的主因。硬實是種子處于逆境下的一種自我保護，在不同遺傳條件、大豆生長后期的環(huán)境條件以及貯藏條件下有不同表現(xiàn)。在多數(shù)情況下硬實并非人們所需，加工產(chǎn)業(yè)可選用非硬實品種提高產(chǎn)品品質(zhì)并降低成本；生產(chǎn)實踐上為獲得高出苗率，除利用育種手段選育非硬實品種外，還可使用機械、溫度、干濕交錯和化學(xué)等處理方法打破硬實大豆種子的休眠。但在種質(zhì)保存過程中可對種子硬實特性加以利用，發(fā)揮堅硬種皮的保水作用。

在大豆研究中對硬實特性有清晰、深入的認(rèn)識可更好的解決生產(chǎn)實踐、加工和種質(zhì)保存上的諸多問題。但目前對硬實的應(yīng)用性研究多于基礎(chǔ)理論研究，而且對硬實形成的研究主要針對種子及種皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對硬實的遺傳研究開展較少且結(jié)論爭議較大。未來的研究還需進一步解析硬實復(fù)雜的遺傳機制，為選育硬實和非硬實品種提供更多的理論依據(jù)，更好的控制并利用這一特性。

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