劉冬娟，肖冰，石玉秀

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.電子顯微學(xué)研究室；2.組織胚胎學(xué)教研室PTSD研究室，沈陽(yáng)110001）

PTSD樣大鼠杏仁核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)

劉冬娟1，2，肖冰1，2，石玉秀1，2

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.電子顯微學(xué)研究室；2.組織胚胎學(xué)教研室PTSD研究室，沈陽(yáng)110001）

目的檢測(cè)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）大鼠杏仁核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白（CRT）表達(dá)的變化。方法建立無(wú)連續(xù)單一刺激（SPS）模型，隨機(jī)將大鼠分為SPS刺激后1 d組（SPS1d）、7 d組（SPS7d）、14 d組（SPS14d）及正常對(duì)照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及透射電鏡技術(shù)，檢測(cè)各組杏仁核神經(jīng)元CRT表達(dá)變化及觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，SPS各組神經(jīng)元CRT陽(yáng)性表達(dá)均增加（P＜0.001），尤以SPS7d組最為明顯。SPS各組神經(jīng)元細(xì)胞核及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均發(fā)生不同程度的改變。結(jié)論SPS可誘導(dǎo)PTSD樣大鼠過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)杏仁核CRT表達(dá)上調(diào)并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路發(fā)生細(xì)胞凋亡。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；杏仁核；神經(jīng)元；鈣網(wǎng)蛋白

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是人們經(jīng)歷巨大災(zāi)難后發(fā)生的以創(chuàng)傷經(jīng)歷回閃、高度警覺(jué)、回避行為為特征的精神疾病。PTSD是創(chuàng)傷后的一種心理失衡狀態(tài)［1］。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)中重要的皮質(zhì)下核團(tuán)，在情緒性學(xué)習(xí)記憶及情緒行為中起關(guān)鍵性作用［2］。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT，又稱鈣網(wǎng)素）是存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要分子伴侶［3］，起著協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊及鈣庫(kù)的作用。當(dāng)非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積時(shí)，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路的細(xì)胞凋亡［4］。我們前期的研究表明PTSD時(shí)杏仁核神經(jīng)元鈣超載［5］，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提示PTSD杏仁核恐懼加劇可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。目前有關(guān)杏仁核CRT變化的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究擬采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR方法及透射電鏡技術(shù)，檢測(cè)PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)元CRT的表達(dá)變化及神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，旨從杏仁核神經(jīng)元CRT表達(dá)變化參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡徑路入手，進(jìn)一步揭示PTSD恐懼加劇發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar健康成年雄性大鼠40只，體質(zhì)量160～200 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠均常規(guī)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、無(wú)連續(xù)單一刺激（single-prolonged stress，SPS）后1 d（SPS1 d組）、7 d（SPS7 d組）、14 d（SPS14 d組），每組10只。

1.2 SPS模型的建立

SPS模型的建立采用國(guó)際公用的PTSD-SPS方法［6］，具體步驟如下：（1）禁錮：將大鼠置入塑料瓶中，頭朝瓶嘴，尾部露在外面，并用透明膠帶將塑料瓶捆緊，水平放置2 h。（2）強(qiáng)迫游泳：將禁錮后的大鼠置入矩形水槽中強(qiáng)迫游泳20 min。矩形水槽高50 cm，邊長(zhǎng)24 cm，水深2/3水槽高度，水溫24℃。（3）乙醚麻醉：強(qiáng)迫游泳后將大鼠放回籠中休息15 min，之后用乙醚麻醉至大鼠意識(shí)喪失。將大鼠放回籠中并常規(guī)飼養(yǎng)，第1天、第7天、第14天分別取材。

1.3 免疫組織化學(xué)光鏡標(biāo)本的制備

大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥腹腔麻醉后暴露心臟，用4%多聚甲醛和0.25%戊二醛灌流固定，續(xù)固定6～10 h后，置于Holt′S液（以40%蔗糖、0.01 mol/L PBS液配制）中。用恒冷箱切片機(jī)行冰凍切片，厚為15 μm。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析

將冰凍切片置于常溫2 h，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；0.3%Triton 10 min×1次；3%H2O2室溫孵育10 min；滴加5%BSA室溫20 min，然后分別滴加一抗兔多克隆抗體CRT（英國(guó)Abcam公司，1∶500）濕盒中4℃過(guò)夜；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG（英國(guó)Abcam公司，1∶500）及SABC（SABC試劑盒，武漢博士德公司），均37℃孵育20 min。PBS液漂洗3次，DAB顯色，脫水、透明、封片并于光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，BX60）下觀察、攝片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

應(yīng)用MetaMorph/DPIO/BX41形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像半定量分析。每組大鼠共選取5張切片，在高倍（×400）視野下，每張免疫組化染色切片取5個(gè)視野，記錄每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞光密度值，取平均光密度。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離杏仁核，利用Trizol試劑提取總RNA。分光光度計(jì)定量后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，CRT的引物序列：上游5′-CAAGGATATCCGGTGTAAGGA-3′，下游5′-CATAG ATATTCGCATCGGGG-3′；β-actin的引物序列：上游5′-GTCACCCACACTGTGCCCATC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′。CRTPCR擴(kuò)增條件：94℃5 min，94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min；β-actinPCR擴(kuò)增條件：94℃4 min，94℃40 s，58℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃8 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照并進(jìn)行積分光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

1.6 透射電鏡樣品制備

取經(jīng)4%多聚甲醛和0.25%戊二醛灌流固定的正常對(duì)照組和SPS各組大鼠杏仁核組織，于2.5%戊二醛中固定。常規(guī)透射電鏡樣品制備，經(jīng)半薄切片定位、超薄切片70 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX透射電鏡下觀察、攝片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

CRT在各組杏仁核神經(jīng)元中免疫組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，定位于胞質(zhì)內(nèi)，胞核呈陰性反應(yīng)。大鼠杏仁核在腦組織中的低倍像（圖1A），正常對(duì)照組（圖1B）細(xì)胞輪廓清楚，反應(yīng)顆粒較少呈淺棕黃色。SPS各組CRT陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)顆粒呈深棕黃色，以SPS7 d組（圖1D）最為明顯。與正常對(duì)照組的光密度值（78.6±8.4）比較，SPS1d組光密度值（101.0 ±11.2）、SPS7 d組的光密度值（120.7±12.1）和SPS14 d的光密度值（83.0±9.0）均明顯增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和SPS各組大鼠杏仁核中CRTmRNA均有一定的表達(dá)，SPS 1 d、7 d、14 d組CRTmRNA表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組的光密度值（0.23±0.03）比較，SPS1 d組光密度值（0.44±0.38）、SPS7 d組的光密度值（0.86± 0.09）、和SPS14 d的光密度值（0.26±0.29）均明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的透射電鏡觀察

正常對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞邊界清楚，核呈圓形、核膜光滑，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主且分布均勻，胞質(zhì)有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、溶酶體等細(xì)胞器（圖3A）。隨著SPS刺激1 d、7 d和14 d的遞增透射電鏡下見(jiàn)SPS各組大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的改變，SPS7 d組神經(jīng)元核膜部分模糊，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集，胞質(zhì)有部分溶解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體多呈嵴減少或少量空泡化、溶酶體增多等改變（圖3C）。SPS1 d組（圖3B）和SPS14 d組（圖3D）神經(jīng)元核內(nèi)染色質(zhì)分布較均勻，核形多不規(guī)則有凹陷，核膜部分模糊，胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜較模糊、部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。

圖1 杏仁核CRT免疫組織化學(xué)的表達(dá)×400Fig.1 Immunohistochemistry of CRT expression in the amygdaloid nucleus×400

圖2 杏仁核CRT mRNA的表達(dá)Fig.2 CRT mRNA expression in the amygdaloid nucleus by RT?PCR

圖3 透射電鏡下各組PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)元×8 000Fig.3 The amygdaloid nucleus neurons of PTSD rats in each group under transmission electron microscope×8 000

3 討論

PTSD等創(chuàng)傷性應(yīng)激相關(guān)精神、行為異常是對(duì)創(chuàng)傷等嚴(yán)重應(yīng)激因素的一種重度精神心理反應(yīng)，PTSD的發(fā)生是個(gè)體內(nèi)部因素和外部環(huán)境相互作用的結(jié)果。近年來(lái)隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、暴力、自然災(zāi)害等的頻發(fā)，其發(fā)病率不斷上升已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。對(duì)PTSD發(fā)病機(jī)制的研究目前多見(jiàn)于前額皮質(zhì)、杏仁核、海馬等大腦部位［7］，杏仁核主司恐懼，有證據(jù)表明杏仁核參與調(diào)節(jié)多重記憶系統(tǒng)對(duì)情緒激發(fā)的感受性［8］。杏仁核還參與介導(dǎo)應(yīng)激行為反應(yīng)以及應(yīng)激性自主神經(jīng)活動(dòng)和應(yīng)激性神經(jīng)內(nèi)分泌的激活。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后正確折疊的場(chǎng)所，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)及儲(chǔ)存Ca2+的場(chǎng)所。Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)游離存在或以結(jié)合于CRT以腔內(nèi)蛋白的形式存在，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)破壞時(shí)，鈣離子及其結(jié)合蛋白可作為促凋亡信使發(fā)揮作用而引起細(xì)胞凋亡。過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是新的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括鈣離子起始信號(hào)和非折疊蛋白反應(yīng)等機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可因鈣離子平衡失調(diào)所致［4］。ERS能激活從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到胞質(zhì)和胞核的信號(hào)傳導(dǎo)，并特異性激活Caspase12［9］，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CRT作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要分子伴侶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的存儲(chǔ)，調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+平衡，從而在機(jī)體鈣平衡中發(fā)揮重要作用。CRT通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+貯存而影響細(xì)胞質(zhì)游離Ca2+水平，具有調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞凋亡的作用，多種疾?。ㄑ仔悦撍枨实龋┑陌l(fā)生與CRT失調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)［10］。我們前期從線粒體路徑（細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9）及凋亡相關(guān)基因bcl-2/bax方面［11］探討了PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞存在細(xì)胞凋亡。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，顯示SPS各組大鼠CRT蛋白水平較正常對(duì)照組顯著上升，尤以SPS7 d組CRT蛋白水平明顯增高，表明PTSD這種超強(qiáng)應(yīng)激，可能會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度，使杏仁核活躍神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)破壞，未折疊蛋白或錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，激活了未折疊蛋白反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期報(bào)道相吻合，CRT的高表達(dá)調(diào)節(jié)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+貯存使細(xì)胞質(zhì)游離Ca2+水平下降，進(jìn)而協(xié)助處理未折疊蛋白反應(yīng)。電鏡下見(jiàn)杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征；胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張等改變，與CRT從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可能影響細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度調(diào)節(jié)的凋亡發(fā)生［12，13］相似，提示PTSD杏仁核恐懼加劇可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，過(guò)強(qiáng)的ERS致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)功能受損，鈣離子及其結(jié)合蛋白CRT作為促凋亡信使可能參與了PTSD樣大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，PTSD致大鼠杏仁核過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)CRT表達(dá)上調(diào)并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路發(fā)生細(xì)胞凋亡，可能是導(dǎo)致PTSD大鼠恐怖加劇的重要病理生理學(xué)分子機(jī)制之一。

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（編輯 武玉欣）

Expression of Calreticulin in the Amygdaloid Nucleus Neurons of Rats with Posttraumatic Stress Disorder

LIUDong-juan1，2，XIAOBing1，2，SHIYu-xiu1，2
（1.DepartmentofElectron Microscopy，College ofBasic MedicalSciences，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofHistology and Embryology PTSDLaboratory，College ofBasic MedicalSciences，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo observe the changes of Calreticulin（CRT）in the amygdaloid nucleus of rats.MethodsThe rats were randomly divided into fourgroups，one group served as normalcontrol，while others were induced forsingle-prolonged stress（SPS）modelas SPS groups（1 d，7 d，14 d）.Immunohistochemistry and RT-PCR were formed to examine the changes of CRT in the amygdaloid nucleus of rat；the neuron ultrastructure of amygdaloid nucleus was detected by transmission electron microscope.ResultsThe expression of CRT in the amygdaloid nucleus increased after SPS stimulation comparing with the normal control group（P＜0.001），and reached the peak in the group of SPS 7 d.There were obvious changes of neuron nucleus and the rough endoplasmic reticulum of amygdaloid nucleus at SPS groups.ConclusionPTSD induced endoplasmic reticulum stressin the amygdaloid nucleus and enhanced the expression ofCRT afterSPS stimulation.SPS stimulation also induced apoptosisthrough endoplasmic reticulum pathway in the amygdaloid nucleus.

posttraumatic stress disorder；amygdaloid nucleus；neuron；calreticulin

R329.4

A

0258-4646（2014）11-0978-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31200772）；教育部博士點(diǎn)基金（20132104110021）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2012225073）

劉冬娟（1962-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科.

石玉秀，E-mail：shiyuxiu@163.com

2014-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：