李萬(wàn)昌+王丹+王俊偉+姬生棟

摘要：以穩(wěn)定的轉(zhuǎn)PEPC基因水稻和未轉(zhuǎn)PEPC基因水稻為供試材料，對(duì)其外形和光合酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)PEPC基因水稻相比，轉(zhuǎn)PEPC基因水稻株高增加、莖稈變粗、葉片變寬、根系發(fā)達(dá)，光合酶活性增加，且產(chǎn)量構(gòu)成因素均增加。

關(guān)鍵詞：水稻；PEPC基因；光合酶活性

中圖分類號(hào)：S511.036 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0023-02

Morphology and Photosynthetic Enzyme Activity of Maize PEPC Transgenic Rice

LI Wan-chang，WANG Dan，WANG Jun-wei，JI Sheng-dong

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The agronomic traits and photosynthetic enzymes activity were studied in maize PEPC transgenic rice and the untransformed rice. The results showed that the plant height was higher， the stalk was stronger， the leaf was wider， the root system was more exuberant than that of the untranformed rice. The photosynthetic enzyme activity was increased and the yield components were improved in PEPC transgenic rice.

Key words： rice； PEPC gene； photosynthetic enzyme activity

收稿日期：2013-04-07

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（102102310318）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1304317）

作者簡(jiǎn)介：李萬(wàn)昌（1974-），男，河南汝州人，副教授，博士，主要從事作物遺傳育種研究，（電話）13264591533（電子信箱）li_wan_chang@163.com。

葉片經(jīng)強(qiáng)光照射導(dǎo)致光合效率長(zhǎng)期降低的現(xiàn)象稱為光抑制，在C3植物中有較高的光呼吸，光抑制是普遍現(xiàn)象，水稻的光抑制現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。而C4植物同化CO2的途徑為C4光合途徑，具有濃縮CO2的機(jī)制，特別在高光、高溫和干旱條件下，具有較高的光合能力和養(yǎng)分利用效率。因此，將C4植物的光合基因轉(zhuǎn)入C3植物水稻中以提高其光合能力的研究備受關(guān)注[1]。早期人們?cè)噲D用常規(guī)雜交的方法將C4植物的性狀轉(zhuǎn)移到C3植物中[2]， 但未獲得成功。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將轉(zhuǎn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）導(dǎo)入水稻，獲得了一些高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株[3，4]。本試驗(yàn)以未轉(zhuǎn)PEPC基因水稻和高表達(dá)轉(zhuǎn)PEPC基因水稻為材料，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的外形和光合酶活性的變化進(jìn)行研究，為應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行水稻的遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以粳稻品種新稻18為基因受體，導(dǎo)入玉米的PEPC基因，獲得不同的轉(zhuǎn)基因水稻材料，這些材料盆栽于河南師范大學(xué)水稻育種試驗(yàn)地，在自然溫光條件下按常規(guī)管理。

1.2 酶液的提取和酶活性的測(cè)定

取水稻葉片2 g 在Tris-HCl 緩沖液中冰浴研磨，8 層紗布過(guò)濾后，將濾液在低溫高速離心機(jī)上于4 ℃下10 000 g離心20 min，棄沉淀，上清液即為酶液。C4 光合酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的酶活測(cè)定參照Gonzalez等[5]的方法，碳酸酐酶（CA）活性測(cè)定按照郭敏亮等[6]的方法，NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH）的活性測(cè)定參照李斌等[7]的方法，RuBP羧化酶（RuBPC）活性的測(cè)定參照Kung等[8]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的形態(tài)比較

將玉米的PEPC基因?qū)胨竞?，獲得了一系列形態(tài)各異的轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照新稻18相比，轉(zhuǎn)基因株系的株高變高，根系發(fā)達(dá)（圖1），葉片變寬，莖稈變粗（圖2）。轉(zhuǎn)基因株系的單株有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、千粒重和單株產(chǎn)量與對(duì)照相比分別提高了30.2%、7.5%、8.9%和32.1%?？梢?jiàn)外形的變化和產(chǎn)量構(gòu)成因素的增加密切相關(guān)。

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照葉片光合酶活性的比較

在正常光照條件[光照350 μmol/（m2·s），21% O2，350 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，測(cè)定了對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、碳酸酐酶（CA）、NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH）和RuBP羧化酶（RuBPC）的活性。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系PEPC的活性明顯高于對(duì)照，而CA、NADP-MDH和RuBPC的活性與對(duì)照相近（圖3A）。在光抑制條件[光照1 000 μmol/（m2·s），2% O2，60 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，轉(zhuǎn)基因株系中RuBPC的活性與對(duì)照相比增加了5%左右（兩者差異不顯著），而轉(zhuǎn)基因株系中PEPC、CA和NADP-MDH的活性比各自對(duì)照分別增加了282.3%、23.1%和25.6%（圖3B）。說(shuō)明在光抑制條件下，轉(zhuǎn)基因水稻中除了PEPC活性增加外，其他C4光合酶也誘導(dǎo)增加，并且高于各自對(duì)照?？梢?jiàn)，轉(zhuǎn)基因株系中，不論何種條件下，PEPC的酶活都高于對(duì)照，可以大大提高光合效率。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態(tài)度，因?yàn)镃4植物葉片具有特殊的Kranz結(jié)構(gòu)，而C3植物中沒(méi)有這樣的結(jié)構(gòu)。但早有報(bào)道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統(tǒng)。將C4循環(huán)酶基因?qū)隒3作物被認(rèn)為是提高作物光合效率和發(fā)揮產(chǎn)量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產(chǎn)物草酰乙酸或蘋(píng)果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環(huán)系統(tǒng)來(lái)提高光合效率的可能性提供了依據(jù)。

常規(guī)育種→生理育種→生物技術(shù)育種是作物育種的發(fā)展趨勢(shì)[13]，其中高光效生理育種是當(dāng)代植物生理和育種工作者共同關(guān)注的問(wèn)題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環(huán)及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導(dǎo)入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發(fā)達(dá)、葉片變寬、莖稈增粗的轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照相比，這些轉(zhuǎn)基因株系的生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均增加，并且其光合酶活性也大大增強(qiáng)，這與焦德茂等[16]的研究結(jié)果一致。周寶元等[17]研究發(fā)現(xiàn)PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力，這和本研究轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)達(dá)、莖稈增粗的形態(tài)變化相一致。轉(zhuǎn)基因株系的外形變化可能是轉(zhuǎn)PEPC基因水稻抗逆增產(chǎn)的生理基礎(chǔ)。因此，在現(xiàn)有良好株型和雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)上，通過(guò)遺傳操作將C4光合酶基因?qū)胛覈?guó)高產(chǎn)水稻品種中，將開(kāi)拓一條新的水稻育種途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] MATSUOKA M， FURBANK R T， FUKAYAMA H， et al. Molecular engineering of C4 photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

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[6] 郭敏亮，高煜珠，王 忠.用酸度計(jì)測(cè)定植物碳酸酐酶活性[J].植物生理學(xué)通訊，1988（6）：59-61.

[7] 李 斌，陳冬蘭，施教耐.高粱NADP蘋(píng)果酸脫氫酶的純化及其分子特性[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，1987，13（2）：113-121.

[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

[9] 李衛(wèi)華，盧慶陶，郝乃斌，等. 大豆葉片C4循環(huán)途徑酶[J].植物學(xué)報(bào)，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 強(qiáng)，盧從明，張其德，等.超高產(chǎn)雜交稻兩優(yōu)培九的光合作用、光抑制和C4途徑酶特性[J].中國(guó)科學(xué)（C輯），2002，45（5）：468-476.

[12] 陳根云，葉濟(jì)宇.草酰乙酸和蘋(píng)果酸對(duì)菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黃雪清，等.轉(zhuǎn)PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素?zé)晒馓匦訹J].科學(xué)通報(bào)，2001，46（5）：414-418.

[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合的抑制作用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力[J].作物學(xué)報(bào)，2012，38（2）：285-292.

（責(zé)任編輯 鄭 威）

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態(tài)度，因?yàn)镃4植物葉片具有特殊的Kranz結(jié)構(gòu)，而C3植物中沒(méi)有這樣的結(jié)構(gòu)。但早有報(bào)道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統(tǒng)。將C4循環(huán)酶基因?qū)隒3作物被認(rèn)為是提高作物光合效率和發(fā)揮產(chǎn)量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產(chǎn)物草酰乙酸或蘋(píng)果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環(huán)系統(tǒng)來(lái)提高光合效率的可能性提供了依據(jù)。

常規(guī)育種→生理育種→生物技術(shù)育種是作物育種的發(fā)展趨勢(shì)[13]，其中高光效生理育種是當(dāng)代植物生理和育種工作者共同關(guān)注的問(wèn)題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環(huán)及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導(dǎo)入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發(fā)達(dá)、葉片變寬、莖稈增粗的轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照相比，這些轉(zhuǎn)基因株系的生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均增加，并且其光合酶活性也大大增強(qiáng)，這與焦德茂等[16]的研究結(jié)果一致。周寶元等[17]研究發(fā)現(xiàn)PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力，這和本研究轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)達(dá)、莖稈增粗的形態(tài)變化相一致。轉(zhuǎn)基因株系的外形變化可能是轉(zhuǎn)PEPC基因水稻抗逆增產(chǎn)的生理基礎(chǔ)。因此，在現(xiàn)有良好株型和雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)上，通過(guò)遺傳操作將C4光合酶基因?qū)胛覈?guó)高產(chǎn)水稻品種中，將開(kāi)拓一條新的水稻育種途徑。

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[9] 李衛(wèi)華，盧慶陶，郝乃斌，等. 大豆葉片C4循環(huán)途徑酶[J].植物學(xué)報(bào)，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 強(qiáng)，盧從明，張其德，等.超高產(chǎn)雜交稻兩優(yōu)培九的光合作用、光抑制和C4途徑酶特性[J].中國(guó)科學(xué)（C輯），2002，45（5）：468-476.

[12] 陳根云，葉濟(jì)宇.草酰乙酸和蘋(píng)果酸對(duì)菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黃雪清，等.轉(zhuǎn)PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素?zé)晒馓匦訹J].科學(xué)通報(bào)，2001，46（5）：414-418.

[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合的抑制作用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力[J].作物學(xué)報(bào)，2012，38（2）：285-292.

（責(zé)任編輯 鄭 威）

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態(tài)度，因?yàn)镃4植物葉片具有特殊的Kranz結(jié)構(gòu)，而C3植物中沒(méi)有這樣的結(jié)構(gòu)。但早有報(bào)道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統(tǒng)。將C4循環(huán)酶基因?qū)隒3作物被認(rèn)為是提高作物光合效率和發(fā)揮產(chǎn)量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產(chǎn)物草酰乙酸或蘋(píng)果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環(huán)系統(tǒng)來(lái)提高光合效率的可能性提供了依據(jù)。

常規(guī)育種→生理育種→生物技術(shù)育種是作物育種的發(fā)展趨勢(shì)[13]，其中高光效生理育種是當(dāng)代植物生理和育種工作者共同關(guān)注的問(wèn)題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環(huán)及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導(dǎo)入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發(fā)達(dá)、葉片變寬、莖稈增粗的轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照相比，這些轉(zhuǎn)基因株系的生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均增加，并且其光合酶活性也大大增強(qiáng)，這與焦德茂等[16]的研究結(jié)果一致。周寶元等[17]研究發(fā)現(xiàn)PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力，這和本研究轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)達(dá)、莖稈增粗的形態(tài)變化相一致。轉(zhuǎn)基因株系的外形變化可能是轉(zhuǎn)PEPC基因水稻抗逆增產(chǎn)的生理基礎(chǔ)。因此，在現(xiàn)有良好株型和雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)上，通過(guò)遺傳操作將C4光合酶基因?qū)胛覈?guó)高產(chǎn)水稻品種中，將開(kāi)拓一條新的水稻育種途徑。

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[9] 李衛(wèi)華，盧慶陶，郝乃斌，等. 大豆葉片C4循環(huán)途徑酶[J].植物學(xué)報(bào)，2001，43（8）：805-808.

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[11] 王 強(qiáng)，盧從明，張其德，等.超高產(chǎn)雜交稻兩優(yōu)培九的光合作用、光抑制和C4途徑酶特性[J].中國(guó)科學(xué)（C輯），2002，45（5）：468-476.

[12] 陳根云，葉濟(jì)宇.草酰乙酸和蘋(píng)果酸對(duì)菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2001，27（6）：478-482.

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[16] 焦德茂，李 霞，黃雪清，等.轉(zhuǎn)PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素?zé)晒馓匦訹J].科學(xué)通報(bào)，2001，46（5）：414-418.

[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過(guò)表達(dá)可以減輕干旱脅迫對(duì)水稻光合的抑制作用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過(guò)表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力[J].作物學(xué)報(bào)，2012，38（2）：285-292.

（責(zé)任編輯 鄭 威）